| 研究課題/領域番号 |
17K00561
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
坂本 綾子 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 放射線生物応用研究部, 上席研究員(定常) (00354960)
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| 研究分担者 |
横田 裕一郎 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 放射線生物応用研究部, 主幹研究員(定常) (30391288)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ヒメツリガネゴケ / DNA修復 / ガンマ線 / 紫外線 / CRISPR/Cas |
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| 研究実績の概要 |
ゲノム維持機構は原始的な生命の時期に原型が作られ、少しずつ変化しながらすべての生物に引き継がれて来たと考えられる。一般に植物は動物に比べてDNA 損傷に対する抵抗性が高く、進化の過程で独自のゲノム維持機構が獲得された事が予想される。本研究では、陸上植物の祖先種に近いヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）を用いて植物のDNA損傷応答や修復・突然変異機構の特徴を明らかにし、高等植物に特異的なゲノム維持機構がどのようにして獲得されたのかを明らかにする。
H30年度は、DNAとDNAトポイソメラーゼ間の共有結合を切断し、ゲノムの安定性維持に働くチロシルDNAホスホジエステラーゼ(TDP1)の欠損株を作成し、トポイソメラーゼ阻害作用のある抗がん剤 に対する感受性を解析した。また、シロイヌナズナのDNA損傷応答に関わる転写因子SOG1のヒメツリガネゴケホモログPpSOG1のゲノム領域をクローニングし、CRISPR/Casによる遺伝子切断と同時にプロトプラストに導入することで、遺伝子置換変異体の作出に成功した。さらに、DNA二重鎖切断修復に関わるいくつかの遺伝子の機能を解析する目的で、RAD51B、POLQ、LigIVの欠損株にガンマ線を照射し、生細胞の数を計測することで感受性を数値化しした。その結果、RAD51B欠損によりガンマ線に対する感受性が非常に高くなることがわかった。これに加え、パルスフィールドゲル電気泳動法でゲノムDNAの断片化度を計測することで、それぞれの変異体のDNA修復効率を測定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度はTDP1遺伝子、SOG１遺伝子の破壊株を作成し、DNA損傷刺激に対する応答を開始した。H29年度に得られた一部の欠損株遺伝子欠損株については、継体培養中に核相が倍加する現象が見られたため、再調整を試みている。また、APT遺伝子を用いての突然変異頻度の検出では、実験系の確立にやや手間取っている。このため、今後はCRISPR/CasによるDNA切断―再結合部位の変異を解析することで、それぞれの遺伝子のDNA二重鎖切断修復における機能解析を進める方針である。
1)チロシルDNAホスホジエステラーゼ(TDP1)は、哺乳動物や高等植物でゲノム安定性維持に関わることが知られている。そこで、TDP1のヒメツリガネゴケホモログ遺伝子の配列からsgRNAを作成し、Cas9遺伝子とともにプロトプラストに導入することで、遺伝子破壊を行った。得られた変異株に対して、トポイソメラーゼ阻害試薬などを添加し、乾燥重量などを指標に耐性の検証を行った。
2)NAC型転写因子であるSOG1はガンマ線照射に応答し、修復遺伝子を含む多数の遺伝子の発現を誘導する事が知られている。そこで、SOG1のヒメツリガネゴケホモログ(PpSOG1)のゲノムDNAをクローニングし、内部を薬剤耐性遺伝子と置換することで遺伝子破壊用コンストラクトを作成した。これと同時に、sgRNA、Cas９遺伝子の三者をプロトプラストに導入することで遺伝子置換変異体を得た。
3)DNA二重鎖切断修復に関わる遺伝子RAD51B、POLQ、LigIVの欠損株と野生株にガンマ線を照射し、植物体の乾燥重量やプロトプラストの増殖能を指標にして感受性の違いを評価した。さらに、パルスフィールドゲル電気泳動法でゲノムDNAの断片化度を計測することで、遺伝子欠損株と野生株のDNA修復効率を測定した。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度の解析で最も放射線感受性が高かったRAD51B欠損株に対して、CRISPR/Cas法で二重鎖切断を導入し、APT遺伝子座における変異を解析することでヒメツリガネゴケのDNA修復の特徴を解析する。
1)Rad51B欠損株からプロトプラストを調整し、Cas9発現プラスミド、APT遺伝子に特異的なsgRNAを発現するプラスミド、および薬剤耐性プラスミドを挿入した後に2-フルオロアデニン(2-FA)を含む培地で培養し、形成されたコロニーの数を指標に突然変異頻度を計測する。また、コロニーの一部を取ってDNAを抽出し、APT遺伝子領域をシークエンスすることで突然変異のスペクトルを解析する。
2)損傷乗り越え複製遺伝子REV3は、紫外線損傷DNAをバイパス複製する際に突然変異を誘発することが知られている。そこで、RAD51B・PpREV3の２重変異株を作成し、突然変異誘発頻度に対する効果を調べる。
3)ヒメツリガネゴケゲノムは、SOG1と相同性の高い別アリル(SOG1-like)を有しており、両者が重複した機能を持っている可能性が高い。そこで、SOG!破壊株のプロトプラストにSOG1-like破壊用のsgRNAを導入することで２重破壊株を作成し、DNA損傷刺激への応答を解析する。
4)突然変異検出の実験系構築に手間取った原因として、相同組換え活性の高いヒメツリガネゴケでは突然変異の誘発頻度が低い可能性が考えられる。そこで、大規模化に向かないプロトプラストではなくホモジナイザーで細断した大量の植物片を用いた突然変異検出の実験系構築を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画ではAPT遺伝子を利用して突然変異スペクトルの解析を行う予定であったが、変異細胞の検出効率が悪く、作業をルーチン化するには至らなかった。このため、実験補助者を雇用して変異解析を行う計画は取りやめ、その他の解析を優先した。繰り越した費用は、次年度からの雇用・消耗品の購入等に当てる予定である。
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