研究課題
DNAは、日光紫外線、放射線、化学物質などの外的な要因、また生体の活動によって生じる活性酸素などの内的な要因により常に損傷を受けている。加えて、DNAに損傷を与える内的な要因として、転写やDNA複製などのDNA代謝に関わるタンパク質の影響も考慮しなければならない。DNA topoisomerase I (TOP1)はDNAに共有結合して一本鎖DNA切断(single strand DNA break; SSB)を入れることで転写やDNA複製の際に生じるDNA構造的位相を解消し、SSBを閉じてDNAから解離する。この一連のTOP1マシナリーが何らかの影響で阻害されることにより様々な問題が生じる。また、「転写と連携した突然変異生成」や各DNA修復系においてTOP1が相関して重要な役割を果たしていることが指摘されているが、どのようなメカニズムでそれぞれが相関しているのか、各DNA修復系にTOP1が直接的に必要であるのかなど全く明らかになっていない。上記を踏まえて、「転写と連携した突然変異生成」の発生と抑制の分子機構についてTOP1の関連性を中心に解析し、その詳細に明らかにすることを本研究課題の目的とする。今年度は昨年度に引き続き「転写と連携した突然変異生成」のメカニズム解析のための「転写を自在に制御した状況下における突然変異を解析する試験系」の構築を試みた。突然変異検出系の標的遺伝子として、転写制御領域を上流に配置して大腸菌gpt遺伝子を用いたDNAコンストラクトを作成した。このコンストラクトをファージベクターに組込み、Tet誘導系の細胞へ導入し、複数のクローンを得た。
2: おおむね順調に進展している
突然変異検出系の標的遺伝子として、転写制御領域を上流に配置して大腸菌gpt遺伝子を用いたDNAコンストラクトを作成し、このコンストラクトをファージベクターに組込んだ系を作成した。これら由来のDNAを市販のTet誘導系の細胞へ導入し、複数のクローンを得た。Tet誘導系の細胞は２種用いたが、クローンが得られたのは片側のみであった。
概ね計画通り進んでいるので、引き続き「転写を自在に制御した状況下における突然変異を解析する試験系」の構築を進める。また、目的のDNAが安定的に導入された市販のTet誘導系の細胞は１種のみであったため、市販のものに加えて新規に自らTet誘導系の細胞を作成し、同様に解析を進める。加えてTOP1タンパク質複合体構成因子およびそのファミリーの相互関係を詳細に明らかにする。
当該年度において、次年度分の一部を前倒し請求することで、当該年度に不足する必要試薬等を追加購入した。ここで購入した試薬等は大容量で購入する方が大幅に安く購入でき、また、当該年度残存分の試薬等は次年度にも用いる。この際に前倒し請求した残額により次年度使用額が生じたが、元来次年度に使用予定であったことに加えて、計画自体は問題なく進んでおり、次年度分助成金と合わせて当初の計画に従って使用する。
すべて 2019 2018
すべて 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (4件) (うち招待講演 1件)
Mutation Research
巻: in press ページ: in press
Genes and Environment
巻: 41 ページ: 5
10.1186/s41021-019-0121-z
