| 研究課題/領域番号 |
17K00862
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
島村 裕子 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (60452025)
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| 研究分担者 |
増田 修一 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 教授 (40336657)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 黄色ブドウ球菌 / ブドウ球菌エンテロトキシンA / ポリフェノール / 相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
【方法】4種のカテキン類 (EC、ECG、EGCおよびEGCG) は、黄色ブドウ球菌の生育を阻害しない濃度以下で各試験に供した。Western Blot解析、表面プラズモン共鳴 (Biacore)、NMR、IR、等温滴定型カロリメトリー (ITC) およびin silicoドッキングシミュレーション解析を用いて、カテキン類とSEAとの相互作用について解析した。さらに、初代細胞によるex vivoの系を用いて、マウス脾臓細胞にSEAを暴露させた際の自然免疫応答のシグナル伝達経路に関与する遺伝子について、リアルタイムRT-PCRおよびマイクロアレイを用いて解析した。
【結果】Western Blot解析により、SEAの毒素活性発現部位とカテキン類の相互作用を検討した。その結果、相互作用強度は、EGCG＞ECG≫EGC＞ECの順であり、EGCGおよびECGはSEAの4ヶ所全ての毒素活性部位と相互作用した。Biacore、NMRおよびIRにより、EGCGとSEAとの相互作用が認められたことから、ITCを用いて、その相互作用様式を検討した。その結果、SEAとEGCGの相互作用により、発熱反応を生じ、EGCGは、SEAの複数の結合サイトと疎水的相互作用することが示唆された。さらに、ドッキングシミュレーション解析の結果、EGCGのガロイル基とEGCのA環は、SEAの毒素活性発現部位のA-6領域のY91と相互作用することが予測された。SEAとEGCGとの相互作用によって発現が変動する遺伝子を明らかにするために、C57/BL6Jマウスから脾臓細胞を調製し、SEAとEGCGを加えてインキュベートした後、細胞からtotal RNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。現在、SEAおよびSEA+EGCGを暴露させた際の発現変動遺伝子について解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マウス脾臓細胞にSEAを添加した際のリン酸化STAT-3 (Tyr705およびSer727) の発現量についてWestern blot解析を行ったが、リン酸化STAT-3の発現量が低かったことから、タンパク質抽出およびWestern blot解析の最適化を行い、系を立ち上げることができた。今後、SEAのgp130分子への結合に対するポリフェノールの影響について調べる予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、昨年度立ち上げた実験系を用い、ポリフェノールによるSEAのスーパー抗原活性阻害能およびgp130分子への結合阻害能について明らかにするために、主に以下の3つについて研究を進めていく予定である。
・SEAとカテキン類の相互作用に及ぼすpHおよびタンパク質の影響について検討する。
・SEAによって誘導されたTh1細胞の応答に対するEGCGの影響について、マイクロアレイ解析を行う。
・SEAのgp130分子への結合に対するポリフェノールの影響について、Western blot解析およびサーマルシフトアッセイを用いて検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
SEAと相互作用・結合するポリフェノールのスーパー抗原活性阻害メカニズムの検討を行うにあたり、当初の計画では、マウス脾臓細胞にSEAとポリフェノールを添加して培養した後、DNAマイクロアレイにより、各試料がいずれの遺伝子群の発現に対して影響するか明らかにする予定であった。しかし、EGCGを添加したマウス脾臓細胞のRNAが分解しやすく、マイクロアレイ解析が困難であった。そのため、当初の計画に加え、RNA抽出・精製を最適化するため、購入予定であった試薬や機器の内訳を変更したことから、次年度使用額が生じた。
本年度は、引き続き、研究費をDNAマイクロアレイ解析およびWestern blot解析の消耗品費等に使用する予定である。また、研究費の一部は、SEAとgp130およびSEAとポリフェノールの相互作用について明らかにするため、サーマルシフトアッセイの消耗品費等に使用する予定である。
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