ゴマリグナン類の抗がん作用の機能解明

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K00874
• 研究機関: 東北医科薬科大学
• 研究代表者: 藤村 務 東北医科薬科大学, 薬学部, 教授 (70245778)
• 研究分担者: 蓬田 伸 東北医科薬科大学, 薬学部, 准教授 (80230845)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: ゴマリグナン類 / セサミン / セサモール / 抗がん作用 / 細胞増殖抑制作用 / アポトーシス誘導 / 薬剤耐性 / 網羅的なタンパク質解析

研究実績の概要

「目的」生活習慣病ともいわれるがんや循環器系疾患および老化の原因の一つとして、活性酸素種による生体内障害であることが知られている。ゴマに含まれるゴマリグナン類はがんの発生要因の一つである活性酸素を除去する作用（抗酸化作用）を有する生理活性物質として注目されているが、抗がん作用（細胞増殖抑制作用）の機能解明は不明なままである。がん感受性細胞にK562細胞、ドキソルビシン耐性がん細胞にK562/DOX細胞を用いてゴマリグナン類の細胞増殖抑制作用の機能解明を行う。
①ゴマリグナン類の一種であるセサミン及びセサモールを処理することによりアポトーシス誘導が関与していることが分かった。このことから、アポトーシス誘導に関連している分子を見つけるために、セサミン及びセサモール処理したK562細胞或いはK562/DOX細胞からタンパク質を抽出後、LC/MS/MSによりSWATHTM法（非標識法）及びiTRAQ法（標識法）を用いて網羅的なタンパク質解析を行った。セサミン及びセサモールを処理することにより明らかに増減するタンパク質が存在してた。
②セサミン及びセサモール処理の毒性評価を、正常細胞としてラット由来の胸腺細胞を用いておこなった。未処理群と比較して細胞致死率と細胞シュリンク率にほとんど変化はなかった。
③マウスを用いたin vivo実験により、セサミン及びセサモール処理による担がんマウスへの延命効果や健常マウスへの影響（副作用など）を検討した結果、セサミン及びセサモールを投与した群において延命効果があった。また、健常マウスへの影響はなかった。次に、血清中のメタボロミクス解析を行った結果、セサミン及びセサモールを投与した群において解糖系、TCAサイクルにおいてがん代謝に関与する物質が増減していた。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

セサミン及びセサモールによるアポトーシス誘導に関連する分子の同定。
アポトーシス誘導が確認されたセサミン及びセサモール投与群とコントロール群（セサミン及びセサモー未 理群）のタンパク質抽出物を用いた。抽出したタンパク質をトリプシン消化後、タンパク質の同定と定量を行った。網羅的なプロテオミクス解析にA) SWATHTM Acquisition with MS/MS法（非標識法）及びB) iTRAQ法（標識法）を用いた。AとBの方法を用いることにより取りこぼしなく、セサミン及びセサモールによるアポトーシス誘導に関連する分子の同定と定量を行えた。その結果、K562細胞においてセサミン投与により有意差をもって増加するタンパク質2種類、減少するタンパク質3種類、セサモール投与により増加するタンパク質3種類、減少するタンパク質1種類を同定・定量した。K562/DOX細胞においてはセサモミン投与により増加するタンパク質1種類、減少するタンパク質2種類、セサモール投与により増加するタンパク質1種類、減少するタンパク質2種類を同定・定量した。いずれも、アポトーシス誘導に関連する分子であった。
現在、同定した分子の機能解析及びin vivo実験において追加実験を行うために関連試 （ELISAキット、抗体、活性測定用試 等）の入手が必要になり時間を要している。また、新型コロナウイルス感染症の拡大による研究計画が停滞している。研究目的を精緻に達成するために研究期間を延長する必要がある。研究計画全体として遅れている。

今後の研究の推進方策

K562細胞及びK562/DOX細胞に対するセサミン及びセサモールのアポトーシス誘導による抗がん作用（細胞増殖抑制作用）の解明
セサミン及びセサモール処理による抗がん作用（細胞増殖抑制作用）はそれらによるアポトーシス誘導が関与することから、今回同定されたタンパク質の生物学的な機能の解明やパスウェイ解析を基にシグナル伝達経路を明らかにする。同定タンパク質がどの様な遺伝子と関連があるのかナレッジデータベースとして解析する。遺伝子、化合物、疾病、生物学的機能、パスウェイを検索し、詳細な働きやそれに関わる分子を抽出し、セサミン及びセサモール処理によるアポトーシス誘導のメカニズムを解明する。また、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ELISA法などにより、アポトーシス関連分子である活性化カスパーゼ分子と相互作用する分子であるかを明らかにする。更に、ELISA法の改良型である多項目同時測定システムを用いることによりアポトーシス関連分子を網羅的に定量し、セサミン及びセサモールの抗がん作用（細胞増殖抑制作用）に関与するレセプター、シグナル因子、制御因子などの分子を多角的に機能解明する。
メタボロミクス解析を進めることによりセサミン及びセサモール処理による抗がん作用（細胞増殖抑制作用）をin vivo実験により評価する。

次年度使用額が生じた理由

（理由）本研究を申請するに当たり計上した研究費については、消耗品を主体とした経費が大部分を占める。同定した分子の機能解析及びin vivo実験において追加実験を行うために関連試 （ELISAキット、抗体、活性測定用試 等）の入手が必要になり時間を要している。また、新型コロナウイルス感染症の拡大による研究計画が停滞している。アポトーシス誘導関連タンパク質の機能解析、in vivo実験の解析、アポトーシス誘導に関連する分子（タンパク質）を、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ELISA法など相互作用解析がまだ、途中であることから、以下の予算を計上した。
（使用計画）アポトーシス誘導関連タンパク質の機能解析及びin vivo実験の解析と再現性を確認する為、残りの予算を使用する。アポトーシス誘導に関連する分子（タンパク質）を、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ELISA法などにより相互作用を解析すする。ELISA法の改良型である多項目同時測定システムを用いることによりアポトーシス関連分子を網羅的に定量し、セサミン及びセサモールの抗がん作用（細胞増殖抑制作用）に関与するレセプター、シグナル因子、制御因子などの分子を多角的に解明するために、消耗品費代が必要になることから未使用分の約116万円（直接経費）を使用する。

研究成果

• [雑誌論文] O-glycosylated clusterin as a sensitive marker for diagnosing early stages of prostate cancer (2021)
  • 著者名/発表者名: Saiko Kazuno , Tsutomu Fujimura, Makoto Fujime , Yoshiki Miura , Takashi Ueno
  • 雑誌名: Prostate 巻: 81 ページ: 170-181
  • DOI: 10.1002/pros.24094
  • 査読あり
• [雑誌論文] Electropolymerization of Azure A and pH sensing using poly(Azure A)-modified electrodes (2021)
  • 著者名/発表者名: Kyoko Sugiyama, Kazuhiro Watanabe, Sachiko Komatsu, Kentaro Yoshida, Tetsuya Ono, Tsutomu Fujimura, Yoshitomo Kashiwagi, Katsuhiko Sato
  • 雑誌名: Analytical sciences 巻: 38 ページ: 113-125
  • DOI: 10.2116/analsci.20P341
  • 査読あり
• [雑誌論文] Electrochemical Detection of Sesamol Dimer and its Application to Measurement of Radicals (2021)
  • 著者名/発表者名: Ken Ichi Ohno, Katsuhiko Sato, Masayuki Kumano, Kazuhiro Watanabe, Tsutomu Fujimura
  • 雑誌名: Analytical sciences 巻: 37 ページ: 633-635
  • DOI: 10.2116/analsci.20N027
  • 査読あり
• [雑誌論文] Electrochemical Quantitative Evaluation of the Surface Charge of a Poly(1-vinylimidazole) Multilayer Film and Application to Nanopore pH Sensor (2021)
  • 著者名/発表者名: Katsuhiko Sato, Fumiya Sato, Masayuki Kumano, Toshio Kamijo, Takaya Sato, Yuanshu Zhou, Yuri Korchev, Takeshi Fukuma, Tsutomu Fujimura, Yasufumi Takahashi
  • 雑誌名: Electroanalysis 巻: 10 ページ: 121-125
  • DOI: 10.1002/elan.202100041
  • 査読あり
• [雑誌論文] Electrochemical Evaluation of Nitroxyl Radical Catalysts and Electrochemical Detection of Cyclosporin A (2021)
  • 著者名/発表者名: Sachiko Komatsu, Yusuke Sasano, Kyoko Sugiyama, Kazuhiro Watanabe, Masayuki Kumano, Kentaro Yoshida, Tetsuya Ono, Yoshiharu Iwabuchi, Tsutomu Fujimura, Katsuhiko Sato, Yoshitomo Kashiwagi
  • 雑誌名: International Journal of Electrochemical Science 巻: 16 ページ: 1-9
  • DOI: 10.20964/2021.02.30
  • 査読あり
• [雑誌論文] Binding Assays Using a Benzofurazan-Labeled Fluorescent Probe for Estrogen Receptor-Ligand Interactions (2020)
  • 著者名/発表者名: Sachiko Komatsu, Ken Ichi Ohno, Tsutomu Fujimura
  • 雑誌名: Chemical and Pharmaceutical Bulletin 巻: 68 ページ: 954-961
  • DOI: 10.1248/CPB.C20-00349
  • 査読あり
• [雑誌論文] Urine lactoferrin as a potential biomarker reflecting the degree of malignancy in urothelial carcinoma of the bladder (2020)
  • 著者名/発表者名: Eiri Matsumura, Noritake Kosuge, Shotaro Nakanishi, Tetsuji Suda, Ai Sugawa, Tsutomu Fujimura, Ryota Miyagi, Naoki Yoshimi, Seiichi Saito
  • 雑誌名: Tohoku Journal of Experimental Medicine 巻: 252 ページ: 2255-244
  • DOI: 10.1620/tjem.252.225
  • 査読あり
• [雑誌論文] Tranilast inhibits pulmonary fibrosis by suppressing TGFβ/SMAD2 pathway (2020)
  • 著者名/発表者名: Motoyasu Kato, Fumiyuki Takahashi, Tadashi Sato, Yoichiro Mitsuishi, Ken Tajima, Hiroaki Ihara, Fariz Nurwidya, Hario Baskoro, Akiko Murakami, Isao Kobayashi, Moulid Hidayat, Naoko Shimada, Shinichi Sasaki, Reiko Mineki, Tsutomu Fujimura, Toshio Kumasaka, Shin Ichiro Niwa, Kazuhisa Takahashi
  • 雑誌名: Drug Design, Development and Therapy 巻: 14 ページ: 4593-4603
  • DOI: 10.2147/DDDT.S264715
  • 査読あり
• [雑誌論文] Conformational diversity of dynactin sidearm and domain organization of its subunit p150 (2020)
  • 著者名/発表者名: Kei Saito, Takashi Murayama, Tomone Hata, Takuya Kobayashi, Keitaro Shibata, Saiko Kazuno, Tsutomu Fujimura, Takashi Sakurai, Yoko Y. Toyoshima
  • 雑誌名: Molecular Biology of the Cell 巻: 31 ページ: 1218-1231
  • DOI: 10.1091/MBC.E20-01-0031
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adsorption and release of rose bengal on layer-by-layer films of poly(vinyl alcohol) and poly(amidoamine) dendrimers bearing 4-carboxyphenylboronic acid (2020)
  • 著者名/発表者名: Kentaro Yoshida, Akane Yamaguchi, Hiroki Midorikawa, Toshio Kamijo, Tetsuya Ono, Takenori Dairaku, Takaya Sato, Tsutomu Fujimura, Yoshitomo Kashiwagi, Katsuhiko Sato
  • 雑誌名: Polymers 巻: 12 ページ: 1854-1871
  • DOI: 10.3390/POLYM12081854
  • 査読あり
• [雑誌論文] Voltammetric ph measurements using azure a-containing layer-by-layer film immobilized electrodes (2020)
  • 著者名/発表者名: Kazuhiro Watanabe, Kyoko Sugiyama, Sachiko Komatsu, Kentaro Yoshida, Tetsuya Ono, Tsutomu Fujimura, Yoshitomo Kashiwagi, Katsuhiko Sato
  • 雑誌名: Polymers 巻: 12 ページ: 1-10
  • DOI: 10.3390/polym12102328
  • 査読あり
• [学会発表] キノリンカルボン酸試 を用いたプロトン親和型誘導体化の開発とLC-ESI-MS/MSによるステロイドの定量 (2020)
  • 著者名/発表者名: 小松 祥子, 大野 賢一, 柴田 憲太朗, 細谷 和也, 藤村 務, 本間 勇大, 西村 朝子, 中北 敏賀, 山下 幸和
  • 学会等名: 日本薬学会第140年会
• [学会発表] LC-ESI-MS/MSによるC21-ステロイド分析におけるプロトン親和性誘導体の評 と定量分析への応 用 (2020)
  • 著者名/発表者名: 中北 敏賀, 小松 祥子, 丹野 あやか, 服部 友亮, 田口 祥子, 東川 理実, 大野 賢一, 藤村 務, 山下 幸和
  • 学会等名: 日本薬学会第140年会
• [学会発表] 電気化学測定によるセサモールの簡易分析法の開発 (2020)
  • 著者名/発表者名: 大野 賢一, 熊野 征行, 佐藤 勝 , 藤村 務
  • 学会等名: 日本薬学会第140年会
• [学会発表] 疾患バイオマーカーの探索 (2020)
  • 著者名/発表者名: 藤村 務
  • 学会等名: 第67回日本臨床検査医学会学術集会
  • 招待講演
• [図書] 臨床病理 (2020)
  • 著者名/発表者名: 諏訪部 章, 共著
  • 総ページ数: 289
  • 出版者: 日本臨床検査医学会