| 研究課題/領域番号 |
17K00900
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| 研究機関 | 神戸薬科大学 |
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研究代表者 |
鎌尾 まや 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (40299087)
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| 研究分担者 |
廣田 佳久 芝浦工業大学, システム理工学部, 助教 (70724277)
須原 義智 芝浦工業大学, システム理工学部, 教授 (30297171)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ビタミンK / menadione / menaquinone-4 / 側鎖切断 |
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| 研究実績の概要 |
食事性ビタミンKから活性型ビタミンＫへの変換中間体であるmenadione（MD）は、リンパ管や血管を介して全身に輸送されると考えられる。我々はLC-MS/MSを用いたMDの測定法を確立し、MDが何らかの抱合体の形で血液中に存在しているのではないかと予想した。しかし、MDは側鎖が無く両親媒性を有し、揮発性が高いことからGCでより有利に測定できる可能性がある。そこで、GCによるMD測定法の確立を試みた。まず、GC-MSを用いてライブラリ検索を行ったところ、MDの質量数のピークが観察されたことから、GCによるMDの測定が可能であると判断された。次にGC-FIDを用いてMDを測定した結果、検出限界は0.3 ngでありLC-MS/MSに比べて低感度であった。固相マイクロ抽出を用いた濃縮による高感度化を試みたが、同時再現性が低く、生体試料の測定に耐えうるMD測定法の確立には至らなかった。
また、ビタミンKの側鎖切断に関わる生体内分子を明らかにする目的で、磁気ビーズを標識したmenaqinone-4（MK-4）標識体を合成した。ヒト肝がん由来 HepG2 細胞の破砕液を用いてABCD アッセイを行い、特異的に結合するタンパク質を精製後、MALDI-TOF/MSによる同定を行った結果、既にMK-4と特異的に結合することが報告されている17β- hydroxysteroid dehydrogenase 4であることが確認できた。今後は、ビタミンKの側鎖切断に関わると考えられる小腸などの組織において、MK-4と特異的に結合するタンパクの同定を試みる予定である。
さらに、ビタミンKの体内動態を明らかにするために、ビタミンKの側鎖として蛍光基である 4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole（NBD）を有する新規蛍光プローブおよびレチノイン酸の側鎖構造を有する誘導体を合成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
活性型ビタミンＫへの変換中間体であるMD測定法として、GC-FIDを用いる方法を検討したが、生体試料の測定に耐えうるMD測定法の確立には至らなかった。しかし、ビタミンKの側鎖切断に関わる生体内分子やビタミンKの体内動態を検討する上で有用なツールとなる新規な磁気ビーズ標識体、蛍光プローブおよびレチノイン酸の側鎖構造を有する誘導体の合成に成功したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、生体内におけるMDの有益な測定法の確立を試みると共に、既に合成済みのMD-グルタチオン抱合体およびMD-N-アセチルシステイン抱合体について、LC-MS/MSを用いた血漿や尿抽出物における測定法を検討する。
また、ビタミンK代謝とビタミン K 栄養状態の関係を明らかにする目的で、PK 含有量を段階的に変化させた飼料でマウスを飼育し、尿、血漿および肝臓、膵臓、精巣、脳の各組織を採取している。これらについて、二クロム酸カリウム処理後のMD検出量（加水分解により遊離するMDの総量）とβ‐グルクロニダーゼ処理後のMD検出量（グルクロン酸抱合されたMD量）を測定し、PK摂取量との関係を解析する。また、 尿中MD排泄量がビタミンK栄養状態の評価指標となり得るかを明らかにする目的で、尿中MD排泄量と PK摂取量、血中ビタミンK類縁体（MD、PK、MK-4、MK-7）濃度およびビタミン K 不足の指標となる低カルボキシル化オステオカルシン（ucOC）濃度との相関性についても解析する。
さらに、2018年度に合成した磁気ビーズ標識体、蛍光プローブおよびレチノイン酸の側鎖構造を有する誘導体を用いて、側鎖切断に関わる生体内分子の探索とビタミンKの体内動態の検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品の納入価格が予定していた額より少額であったため。
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