浸透圧負荷に対する血管内皮細胞の応答のバイオメカニクス

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K01381
• 研究機関: 藍野大学
• 研究代表者: 宮崎 浩 藍野大学, 医療保健学部, 教授 (00263228)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 浸透圧 / 内皮細胞 / バイオメカニクス / アクチンフィラメント / 力学的特性

研究実績の概要

本研究では，高張液・低張液による浸透圧負荷が，血管内皮細胞のF-アクチン／ストレスファイバー構造および力学的特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。
1) 低張液・高張液が培養内皮細胞のF-アクチンに及ぼす影響：　ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）を培地中で24時間静置培養した後に，培地を等張液，高張液，または低張液と入れ替えて所定の時間37℃に保温した。F-アクチンを蛍光染色してその状態を共焦点レーザ顕微鏡で観察したところ，等張液と高張液を作用させた場合には大きな変化は見られなかったが，低張液を作用させると時間とともにF-アクチン／ストレスファイバー構造が大きく変化する結果を得た。溶液の浸透圧測定には，購入した自動浸透圧計を用いた。F-アクチンを観察するために蛍光標識アクチン遺伝子の導入を行う予定であったが，観察するのに適切な導入効率と蛍光強度を得られなかったため，今年度は細胞を所定の時間だけ溶液に曝した後にホルマリン固定してF-アクチンの蛍光染色と観察を行った。
2) 平行平板型流れ負荷装置の作製：　培養細胞に流れせん断応力を負荷することのできる平行平板型流れ負荷装置を作製した。装置は，細胞を培養したガラスボトムディッシュと組み合わせて形成される平行平板型フローチャンバー，ローラーポンプ，リザーバー，ダンピングチャンバー，チューブ回路からなり，フローチャンバーは顕微鏡ステージ上に設置することが可能である。培養HUVECsに37℃の溶液を循環させて1 Paの流れせん断応力を負荷したところ，チャンバー内の流れは層流とみなせ，6時間にわたって同じ細胞の形態を経時的に観察することが可能であった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

細胞のF-アクチンを観察するために蛍光標識アクチン遺伝子を導入してライブイメージングを行う予定であった。しかし，細胞全体にわたってF-アクチンを経時的に観察するのに適切な蛍光強度を得るための遺伝子導入条件を確立することができなかった。この点は遅れているが，ホルマリン固定した細胞の観察によって低張・高張液の作用によるF-アクチンの変化は観察できており，また，平行平板型流れ負荷装置の作製と性能確認も概ね終了している。

今後の研究の推進方策

F-アクチンの変化を詳細に調べるためには，同じ細胞で細胞底部から上部までを経時的に繰り返しライブイメージングによって観察できることが望ましい。そのため，引き続き蛍光標識アクチン遺伝子の導入条件の確立を行い，低張液がF-アクチン／ストレスファイバー構造に及ぼす影響を詳細に調べる。今後は，さらに，低張液・高張液による流れ負荷が培養内皮細胞のF-アクチンおよび力学的特性に及ぼす影響を調べていく予定であるが，フローチャンバーを顕微鏡ステージ上に固定するためのホルダーをアルミニウムで製作したため底面の強度が低く，変形により対物レンズと干渉するため観察可能領域が限定されてしまっていた。そのため，チャンバーホルダーの材質をステンレス鋼に変更して作製し直して観察領域の選択の幅を拡げるようにする。

次年度使用額が生じた理由

3万円余りの未使用額が生じているが，これは，年度内に調査旅費として使用する目的で残していたが使用しなかったものである。次年度分の交付額と合わせて，研究の推進に必要な物品の購入および学術集会への参加を行うための費用に充てる。