| 研究課題/領域番号 |
17K01381
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| 研究機関 | 藍野大学 |
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研究代表者 |
宮崎 浩 藍野大学, 医療保健学部, 教授 (00263228)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 浸透圧 / 内皮細胞 / バイオメカニクス / アクチンフィラメント / 力学的特性 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，高張液・低張液による浸透圧負荷が，血管内皮細胞のF-アクチン／ストレスファイバー構造および力学的特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。
1) 低張液・高張液による流れ負荷が培養内皮細胞のF-アクチンに及ぼす影響： ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）を培地中で24時間静置培養した後に，前年度に作製した平行平板型流れ負荷装置を用いて，この細胞に等張液，高張液，または低張液によって4時間の流れ負荷（せん断応力 = 2 Pa）を作用させた。その後， F-アクチンを蛍光染色してその状態を共焦点レーザ顕微鏡で観察したところ，高張液を作用させた場合には等張液の場合と同様にほとんどの細胞に明瞭なストレスファイバーが観察されたが，低張液を作用させた場合にはストレスファイバーが減少している細胞がみられた。
2) 低張液が培養内皮細胞の力学的特性に及ぼす影響： HUVECsを培地中で24時間静置培養した後に，平行平板型流れ負荷装置を用いて，この細胞に等張液または低張液によって4時間の流れ負荷（せん断応力 = 2 Pa）を作用させた。その後，トリプシン処理で剥がした細胞のマイクロピペット吸引試験を行った。しかし，流れを作用させた部分のみからの細胞の回収が難しく，さらに細胞数が少ないため試験チャンバー内で状態の良い細胞を見つけるのに時間を要し，流れ負荷終了から力学試験開始までに30分程度経過してしまった。そのため，現段階で得ているデータには信頼性がないものと考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
当初の計画では，細胞のF-アクチンを観察するために蛍光標識アクチン遺伝子を導入してライブイメージングを行う予定であったが， F-アクチンを経時的に観察するのに適切な蛍光強度を得るための遺伝子導入条件はまだ確立できていない。エレクトロポレーション法とリポフェクション法を試しているが，使用しているDsRed-monomerアクチンベクターをHUVECに導入する条件はかなりシビアなようである。また， 流れ負荷終了からマイクロピペット吸引試験開始までに30分程度要しているため，この時間を大幅に短縮して一連の手順を確立する必要がある。
平成30年6月18日に発生した大阪府北部地震により建物および顕微鏡やマイクロマニピュレータを含む実験機器が損傷を受け，復旧に時間を要したため，条件出しの予備実験を含む実験実施が大幅に遅れたことが大きい。また，実験を進めていく中で，低張液の調製方法や保温環境が結果に影響を及ぼすような所見がみられ，そのことについて検証を行っているため，当初の計画よりも遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
F-アクチンの変化を詳細に調べるためには，同じ細胞で細胞底部から上部までを経時的に繰り返しライブイメージングによって観察できることが望ましい。そのため，引き続き蛍光標識アクチン遺伝子の導入条件の確立を進めるが，HUVECよりも遺伝子導入を行いやすい種類の内皮細胞を実験に使用することも考える。今後は，さらに，低張液・高張液による流れ負荷が培養内皮細胞のF-アクチンおよび力学的特性に及ぼす影響を調べていく予定であるが，溶液の調製方法や細胞に浸透圧を負荷している際の保温環境が結果に影響を及ぼす可能性があるため，先これらの点の検証を進める必要がある。また，流れ負荷終了からマイクロピペット吸引試験開始までの一連の手順を確立した後に，力学試験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
約29万円の次年度使用額が生じているが，これは，大阪府北部地震による被害からの復旧に時間を要して研究が遅れ，物品の購入が少なかったためである。次年度分の交付額と合わせて，研究の推進に必要な物品の購入および学術集会への参加を行うための費用に充てる。
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