| 研究課題/領域番号 |
17K01395
|
|---|
| 研究機関 | 日本大学 |
|---|
研究代表者 |
石原 務 日本大学, 工学部, 教授 (70349554)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | バイオ医薬 / バイオベター / 抗体 / 酵素 / 化学修飾 / レシチン |
|---|
| 研究実績の概要 |
ライソゾーム酵素のアガルシダーゼあるいはヒト化抗ヒトIgEモノクローナル抗体のオマリズマブをレシチンで化学修飾したバイオベター（改良型バイオ医薬品）の開発を行ってきた。平成29年度は、主にオマリズマブ及びアガルシダーゼへのレシチン修飾法の確立を試みた。
アガルシダーゼは酵素であるためレシチン修飾反応により変性失活することが懸念される。そこで、まず反応条件がレシチン修飾率と酵素活性に及ぼす影響を検討した。その結果、混合する有機溶媒はDMSOが最適であり、その混合比を35％とすることでレシチンの修飾と活性が維持できることがわかった。また、レシチン修飾ファブラザイムをゲル電気泳動解析すると、レシチンの修飾量に応じファブラザイムが正極側にシフトしたことから、レシチンはファブラザイムのアミノ基と結合していることが示唆された。さらに、3種の培養細胞（ヒト子宮頸がん由来細胞、ヒト不死化肝星細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞）への取り込みを評価したところ、レシチン化することで全ての細胞で多く取り込まれるようになり、最適なレシチン修飾率が存在することがわかった。
一方、オマリズマブは50％DMSO溶液中でレシチン修飾反応をおこなった。HPLCとゲル電気泳動解析から仕込みのレシチン量に応じ修飾されることがわかった。また、IgEに対するELISAを利用することで、レシチン化オマリズマブが抗原（IgE）に対する結合性を維持していることが確認できた。さらに、レシチン化オマリズマブは培養細胞（ヒト好塩基球性白血病細胞、ラット好塩基球性白血病細胞)に顕著に取り込まれることがわかった。特に、オマリズマブに対するレシチンの仕込み重量比0.3で合成したオマリズマブが最大の取り込みを示したことから、細胞親和性を高める最適なレシチン修飾率が存在することが明らかになった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は当初の予定通り、レシチン修飾タンパク質の修飾法を確立することに成功した。タンパク質の活性評価、培養細胞との親和性評価も実施しほぼ終了した。血漿タンパク質及び血球細胞との相互作用解析および細胞毒性評価については、その予備検討まで既に終了している。以上より、本年度は滞りなくおおむね順調に予定を達成できたといえる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
作製したレシチン化タンパク質を用い、血漿タンパク質及び血球細胞との相互作用と細胞毒性を評価する。得られた結果と細胞への取り込み試験の結果から、活性が維持され、細胞との親和性が高く、細胞毒性が低い修飾体をスクリーニングし最終製剤の修飾率を決定する。
次に、培養細胞を用いたタンパク質の活性評価を行う。オマリズマブの活性は、ヒト好塩基球性細胞株のKU812細胞を用い、刺激により放出されるヒスタミンをEIAにより定量する。アガルシダーゼの細胞内での酵素活性は、種々の細胞にガラクトシダーゼの基質であるX-α-Galを添加し評価する。さらに、正常マウスに蛍光ラベルしたレシチン修飾オマリズマブあるいはアガルシダーゼを静脈注射し臓器集積性をin vivo蛍光イメージングシステムにより観察する。
|
