| 研究課題/領域番号 |
17K01886
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| 研究機関 | 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛 |
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研究代表者 |
石塚 俊晶 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 薬理学, 教授 (30399117)
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| 研究分担者 |
佐藤 泰司 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 薬理学, 准教授 (10505267)
野村 さやか 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 薬理学, 助教 (20791651)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | インフラマソーム / 神経前駆細胞 / TNF / IL-1beta / IL-18 / 神経分化 |
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| 研究実績の概要 |
最近の疫学研究により、メタボリックシンドロームがアルツハイマー病の危険因子であると報告されている。一方、メタボリックシンドローム患者の脂肪組織からTNFなどの炎症性サイトカインが過剰産生されている。また、炎症応答に重要な細胞内蛋白質複合体インフラマソームがTNF等で活性化されるが、その過剰活性化が神経再生障害と関連することが指摘されている。さらに、認知機能障害と海馬の神経前駆細胞の機能低下の関連性も示唆されており、メタボリックシンドロームでの神経前駆細胞のインフラマソーム活性化が細胞機能の低下を惹起し、認知機能障害につながっている可能性が考えられる。そこで、まず、我々は、健常マウスの人工多能性幹細胞(iPS細胞)より分化誘導した神経前駆細胞にTNF (1～100 U/ml)の刺激を行い、インフラマソームの構成蛋白質であるNLRP3およびcleaved caspase-1(活性型caspase-1), IL-1beta, IL-18の発現が増加することをウェスタンブロット法で確認した。次に、MTTアッセイ法により細胞増殖活性を検討したが、TNF (1～100 U/ml), IL-1beta (0.1～1 ng/ml), TNF + IL-1betaのいずれの刺激でも有意な影響はみられなかった。また、レチノイン酸による神経細胞への分化誘導時にTNF (1～100 U/ml)の刺激は明らかな影響を与えなかったが、TNF 100 U/mlに加えIL-1beta (0.3～1 ng/ml)あるいはIL-18 (1～3 ng/ml)の刺激を加えると、神経細胞への分化が有意に抑制された。以上の結果により、マウス神経前駆細胞において、TNFによりインフラマソームが活性化され、それに伴い産生増加するIL-1betaやIL-18がTNFとともに神経分化を阻害している機序が明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初は、上記の検討に加えて、メタボリックシンドロームの動物モデルであるob/obマウスより神経前駆細胞の単離や海馬・側脳室周囲を含む冠状断の脳組織切片の作成を行い、健常マウスの神経前駆細胞および脳組織切片とのインフラマソーム活性化や神経前駆細胞機能、神経新生の比較検討を行う予定であったが、組み換えDNA実験計画の学内承認および動物実験計画の学内倫理委員会での承認が遅れたため、現在、実験準備の段階である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は、学内組み換えDNA実験安全委員会および動物実験倫理委員会において承認されたため、現在、ob/obマウスからの神経前駆細胞の単離や海馬・側脳室周囲を含む冠状断の組織切片の作成とそれらの培養に向けた準備を行っており、健常マウスとの比較検討が推進可能となった。また、H30年度に実施予定の「脳内インフラマソーム活性化刺激がメタボリックシンドローム疾患モデル動物の海馬神経新生や認知機能に及ぼす影響」に関しても、現在、健常マウスを用いてstereotaxic injection法により海馬に直接薬物を投与する予備実験を行っている。予備実験により実験手技の習熟を十分に行った後、ob/obマウスおよび健常マウスの海馬にTNF投与を行い、脳内インフラマソーム活性化刺激による影響を検討していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）H29年度は、学内のDNA実験安全委員会および動物実験倫理委員会の承認が遅れたため、メタボリックシンドローム疾患モデルであるob/obマウスからの神経前駆細胞の単離および海馬・側脳室周囲を含む冠状断の脳組織切片の作成が十分に行えず、それらの培養や蛍光抗体染色、免疫組織染色に必要な試薬や消耗品類が未使用であった。
（使用計画）DNA実験および動物実験が承認されたため、試薬・消耗品の調達と実験準備が終わり次第、培養と刺激実験を行う予定である。また、H29年度中にマウス海馬へのstereotaxic injection法を用いた薬物投与の予備的実験を実施しており、H30年度に計画されている「ob/obマウスの海馬へのTNF投与による脳内インフラマソーム活性化刺激による神経新生および認知機能に与える影響」に関する検討を計画通りに実施する予定である。このため、H29年度の残額とH30年度の全額を使用する予定である。
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