2017 年度実施状況報告書

腸内細菌由来OMVの生理・病理的役割の解明

研究課題

研究課題/領域番号	17K01888
研究機関	地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所)
研究代表者	藤田泰典地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究員 (30515888)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード	慢性炎症 / 腸内細菌
研究実績の概要	本研究課題では、グラム陰性細菌が放出する膜小胞Outer membrane vesicle (OMV)の生理的・病理的な役割の解明を目指し、大腸菌由来OMVの生体内への侵入経路、体内動態、標的組織を明らかにすることを目的としている。また、大腸菌由来OMVが高脂肪食摂取マウスや次世代型アルツハイマー病モデルマウスの病態の発症や進行に及ぼす影響を検討し、OMVの観点から、腸内細菌と慢性炎症・代謝性疾患・神経変性疾患との関連およびその分子機構について新知見を得る。平成29年度は血中OMVの体内動態を検討するために、大腸菌由来OMVを測定する実験系の構築を試みた。組換え実験に使用される大腸菌株の培養上清を回収し、超遠心法によりOMVを単離した。OMVの表面に存在する分子に対する抗体を用いてELISAを構築した。その結果、OMVに対する濃度依存的なシグナルが検出された。次に、構築した実験系を用いてマウス血清中に添加したOMVの検出を試みた結果、OMV添加を示すシグナルは検出されたが、シグナル強度は低く、血清中の成分により抗体抗原反応が強く阻害されているものと考えられた。今後、詳細な条件検討と最適化が必要であることが分かった。一方、本課題ではアルツハイマー病モデルマウスにOMVを投与する実験を予定しており、今年度は繁殖と系統維持を行った。また、アミロイドβの沈着を免疫組織染色及びELISA法で確認し、病態を評価するための実験系を確立した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由平成29年度は、大腸菌由来OMVを測定する実験系の構築を計画していた。この計画に従い、大腸菌の培養上清から単離したOMVを用いてELISAの構築を試みた。OMVの表面に存在する分子に対する抗体を用いることにより、実際にOMVを濃度依存的に検出することに成功した。しかしながら、血清中のOMVを検出し、定量的に測定するには条件検討と最適化が必要であることが明らかになった。当初の計画では、OMVを投与したマウスの血中OMVの測定も予定していたが、実施するに至らなかった。一方、平成30年度以降に予定しているアルツハイマー病モデルマウスを用いた実験のために、病態を評価するための実験系の構築を前倒しで実施することができた。したがって、総合的にはおおむね順調に進展しているものと考えられる。
今後の研究の推進方策	今後の推進方策として、①大腸菌由来OMVを測定する実験系の構築、②大腸菌由来OMVの標的組織と体内動態の同定、③大腸菌由来OMVと慢性炎症の関連解析、④大腸菌由来OMVがアルツハイマー病モデルマウスの病態に与える影響を検討する予定である。平成30年度は、①～③を計画している。これまでの経験から、血中OMVを定量的に測定するELISAの構築には困難を要することが予想させる。その場合は、ELISA以外の方法も検討する。また、②の標的臓器の同定や③の慢性炎症との関連解析を優先して実施することも検討する。
次年度使用額が生じた理由	当初の計画では、OMVを投与したマウスの血中OMVの解析も予定していたが、実施するに至らなかった。その為、それらの実験に必要な実験動物や物品の購入を延期したため、次年度使用額が生じた。平成29年度に実施するに至らなかった動物実験に必要な実験動物や物品の購入に使用する予定である。