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2019 年度 実施状況報告書

金属酵素の機能制御機構における酵素分子全体の動的構造効果:モデル蛋白質による検証

研究課題

研究課題/領域番号 17K01947
研究機関奈良先端科学技術大学院大学

研究代表者

松尾 貴史  奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (50432521)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2021-03-31
キーワード金属酵素 / サブチリシン / 金属配位 / 補助配位子
研究実績の概要

金属含有酵素の機能の発揮箇所である中心金属イオン部分の反応性が、生体高分子全体の構造柔軟性とカップルしているという知見から、1)人工金属酵素の反応性制御が構造柔軟性によって可能であること 2)構造柔軟性効果が金属配位部位に伝搬する経路の解明を行うために、大腸菌によるサブチリシンカールスバーグの発現系の構築を試みた。分子シャペロンとして機能するプロドメインを有する全長チオールサブチリシンをコードするプラスミドを調製し、Ser221Cys変異による自己活性化への影響を検討した。その結果、サブチリシンの活性部位の変異によって、自己活性化速度は著しく低下するが、最終的にはプロドメインの切断が起こった成熟型サブチリシンが生成することが明らかとなった。しかし、成熟型タンパクの収率は30%程度であり、また、CDスペクトルによる二次構造への影響を検討し、化学修飾によって調製したタンパク質と比較としたところ、部分的な変性が見られ、自己活性化およびその後の精製方法の検討が必要なことが示唆された。生成した成熟型タンパク質はCu(II)やZn(II)などの遷移金属を結合する能力をがあることをICP-MSによって確認し、これまでの研究の知見と総合させて、生体高分子全体の構造柔軟性制御によって反応性を変化させることのできる人工金属酵素の構築において、サブチリシンがフレームワークとなるモデルタンパク質として有効であることが実証された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

構造柔軟性効果が伝搬経路解明に必要な変異体構築に必要な人工遺伝子の入手が、新型コロナウィルス感染拡大に伴う発注先の操業停止に伴い困難となったため、変異体構築が遅れている。

今後の研究の推進方策

期間延長手続きをすでに行い、発注先の操業が再開されたので、入手次第、変異体発現系の構築およびタンパク質調製を行い、変異位置による構造柔軟性効果への影響を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

新型コロナウィルス感染症拡大に伴う実験材料の入手困難が生じたため、次年度使用額が生じた。実験材料の入手次第、変異体発現系の構築およびタンパク質調製を行い、変異位置による構造柔軟性効果への影響を明らかにする。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2020 2019 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 1件)

  • [国際共同研究] Jadavpur University(インド)

    • 国名
      インド
    • 外国機関名
      Jadavpur University
  • [雑誌論文] Porphyrin-based Probe for Simultaneous Detection of Interface Acidity and Polarity during Lipid Phase Transition of Vesicles.2020

    • 著者名/発表者名
      Rini Majumder, Snigdha Roy, Kentaro Okamoto, Satoshi Nagao, Takashi Matsuo, Partha Pratim Parui
    • 雑誌名

      Langmuir

      巻: 36 ページ: 426-434

    • DOI

      10.1021/acs.langmuir.9b02781

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Regioselective Chemical Modification of Cysteine Residues on Protein Surfaces Focusing on Local Environment around the Conjugation Sites2020

    • 著者名/発表者名
      Teruyuki Miyake, Ryosei Tamaki, Moeko Asanuma, Yoji Fukada, Shun Hirota, Takashi Matsuo
    • 雑誌名

      Bioconjugate Chem.

      巻: 31 ページ: 794-802

    • DOI

      10.1021/acs.bioconjchem.9b00869

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Recent Developmetns on Creation of Artificial Metalloenzymes.2019

    • 著者名/発表者名
      Takashi Matsuo, Teruyuki, Miyake, Shun Hirota
    • 雑誌名

      Tetrahedron Lett.

      巻: 60 ページ: 151226(1-8)

    • DOI

      10.1016/j.tetlet.2019.151226

    • 査読あり
  • [学会発表] アデニル酸キナーゼ三変異体(A55C/C77S/V169C)の表面システイン残基の反応性に対する局所的構造要因の検証2020

    • 著者名/発表者名
      玉置椋星、三宅輝幸、浅沼萌子、松尾貴史、廣田俊
    • 学会等名
      日本化学会第100春季大会
  • [学会発表] Sequential Conjugation of Different Molecules onto Protein Surface and Comparison of Reactivities of Cysteine Residues2019

    • 著者名/発表者名
      Teruyuki Miyake, Yoji Fukada, Shun Hirota, Takashi Matsuo
    • 学会等名
      15th International Symposium on Applied Bioinorganic Chemistry (ISABC15)
    • 国際学会
  • [学会発表] ヘム鉄の軸配位子としてイミダゾールをもつミオグロビンの研究2019

    • 著者名/発表者名
      杉田達郎、百武篤也、山本泰彦、松尾貴史、廣田俊、鈴木秋弘、根矢三郎、荘司長三、渡辺芳人
    • 学会等名
      第46回生体分子科学討論会
  • [学会発表] システイン残基周辺の局所的環境の違いを利用したタンパク質化学修飾の反応制御2019

    • 著者名/発表者名
      松尾貴史、三宅輝幸、廣田俊
    • 学会等名
      第19回蛋白質科学会年会

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公開日: 2021-01-27  

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