| 研究課題/領域番号 |
17K01956
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
淺沼 三和子 国立研究開発法人理化学研究所, 袖岡有機合成化学研究室, 特別研究員 (70381598)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 標的タンパク質同定 / 質量分析 / 蛍光標識 |
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| 研究実績の概要 |
既に開発している、生物活性化合物の標的タンパク質選択的にNBD蛍光基を結合させる蛍光標識法により、NBD標識されたタンパク質を質量分析法で同定することは可能であったが、NBD標識ペプチドの検出は容易ではなかった。本研究では、光照射によりNBD標識ペプチドからNBD部分が脱離する現象に着目し、液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）を用いたNBD標識ペプチド選択的な分析法を確立し、標的タンパク質のNBD修飾部位同定を目指した。
初年度は、NBD標識ペプチド選択的な光照射LC-MS/MS分析に必要な条件を探索するため、NBD蛍光基を導入したペプチドをモデルペプチドとして準備し、光照射によるNBD脱離の確認をLC-MSで行った。その結果、モデルペプチドからNBDが脱離して生じた分子を確認でき、この現象は非標識ペプチド混合溶液中にモデルペプチドを少量添加した際にも見られたことから、細胞抽出物などの混合溶液中からNBD標識ペプチドの検出を行うといった複雑な系への適用も可能であることがわかった。また、実験を進めていくなかで、LC-MS導入前に試料の複雑性を下げることが有効であることがわかり、試料調製法を検討したところ、分析に適した手法の知見を得ることができた。一方で、LCのメンテナンスやシステム構築に時間を要し、NBD標識ペプチド選択的な分析条件を決定するまでには至らなかったが、分析条件に関していくつかの知見が得られ、LC-MSシステム構築に着手することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
NBD標識ペプチド選択的な分析法の確立に向けて、試料調製法の検討やMS/MSメソッド作成に着手できており、LC-MSシステム構築においては、いくつかの知見が得られている。これらの知見を基に、LC-MSシステム構築の最適化を進めながら、試料の測定を開始できると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度に準備したモデルペプチドを用いて、引き続きNBD標識ペプチドを効率的にLC-MS/MSで同定する手法の確立（試料調製法の確立、LC-MSシステム構築、およびMS/MSメソッド作成など）を目指す。LC-MSシステムにおいては、初年度に得られた知見に基づき、分析カラムやペプチドの溶出条件を確定する。そして、試料調製法およびMS/MSメソッド作成においては、試料に応じた最適化を行う。また、NBD脱離現象の汎用性を調査するため、初年度に準備したモデルペプチド以外にも多種多様なNBD標識ペプチドを準備し調査を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
LC-MSに関連する一部消耗品の購入時期を次年度としたため。また、当初計画していた学会への参加を次年度にすることとしたため。
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