| 研究課題/領域番号 |
17K05764
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| 研究機関 | 東邦大学 |
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研究代表者 |
細井 晴子 東邦大学, 理学部, 准教授 (00313396)
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| 研究分担者 |
宮武 秀行 国立研究開発法人理化学研究所, 伊藤ナノ医工学研究室, 専任研究員 (50291935)
内田 朗 東邦大学, 理学部, 教授 (30176680)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 蛍光タンパク質 / 蛍光寿命 / X線結晶構造解析 / 発光メカニズム / レーザー分光法 |
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| 研究実績の概要 |
申請者はこれまでに、黄色蛍光タンパク質eYFP のY145 変異体計20 種類を作製し、時間分解蛍光測定によりその蛍光寿命を測定した。その結果、Y145 変異体の蛍光寿命は、アミノ酸一つの違いで3.4 nsから82 ps まで大きく変化し、145 番アミノ酸側鎖体積が小さくなるほど蛍光寿命が短くなる、つまり光らなくなることを明らかにした。本申請課題では、eYFP Y145 変異体の蛍光寿命の変化の起源を明らかにし、それを土台としてオワンクラゲ由来蛍光タンパク質 に共通する性質を見出すことを目的とする。これまでに得られた結果を以下に示す。
・eYFP とそのY145 変異体の結晶構造解析
上記計20 種類の結晶化とX 線結晶構造解析を行い、得られた構造からY145 変異による寿命の変化の起源となる構造変化を見出す。平成29年度には、eYFP野生型とその13種類の変異体（Y145D、Y145F、Y145G、Y145M、Y145Q、Y145T、Y145V、Y145W、Y145C、Y145E、Y145H、Y145L、Y145N）の結晶構造を決定した。得られた構造の比較から、Y145側鎖体積が小さい変異体では、発色団とY203（発色団とパイスタッキングすることでYFPの黄色シフトをもたらすアミノ酸）との距離が長くなっていることが明らかになった。
・「より光る」または「より光らない」新規蛍光タンパク質の予測・作製
他の色のオワンクラゲ由来蛍光タンパク質、eBFP、eCFP、eGFP のY145変異体を作製し、その蛍光寿命を測定した。これらの変異体の蛍光寿命の側鎖体積依存性は、eYFPのそれとは異なる場合があることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
eYFP とそのY145 変異体の結晶構造解析は、当初の計画以上に進展している。アミノ酸一つの違いにもかかわらず同じ条件では結晶化しないが、類似の条件で結晶が得られることが分かってきたためである。
その他の色のオワンクラゲ由来蛍光タンパク質、eBFP、eCFP、eGFP のY145変異体の作製も順調に行うことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き構造未決定のeYFP Y145変異体の結晶化と構造解析を進める。また、得られた知見を基に、まずeYFP について最小限の変異で「より光る」または「より光らない」変異を予測し、変異体を作製する。作製した変異体の評価は、蛍光寿命測定と結晶構造解析によって行う。その他の色の蛍光タンパク質については、必要に応じて結晶構造解析を行い、eYFPとは異なる体積依存性の起源を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
タンパク質作製に必要な試薬やプラスチック製品などの消耗品購入に使用する予定である。
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