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2018 年度 実施状況報告書

ラマン分光法を用いたウイルス感染のリアルタイム分析

研究課題

研究課題/領域番号 17K05914
研究機関関西学院大学

研究代表者

佐藤 英俊  関西学院大学, 理工学部, 教授 (10300873)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワードラマン分光法 / ウイルス
研究実績の概要

本年度は計画に沿って,DNAウイルスであるアデノウイルスに続き,レトロ(RNA)ウイルスであるレンチウイルスを用い,感染に対するHEK293細胞の応答について研究を進めた。アデノウイルスと同様に,感染3時間で細胞のラマンスペクトルに変化が観測され,ウイルス感染の検出が可能であることが示唆された。
レトロウイルスのRNAゲノムは逆転写酵素を経て宿主染色体に組み込まれる。本研究に用いたレンチウイルスは遺伝子組み込み実験用で,カプシドタンパク質を別に合成して与えなければウイルスとして発現することは無い。従って,HEK293に感染すると,組み込み用に与えたEGFPゲノムを宿主細胞に組み込むが,ウイルス自身が増殖することは無い。今回観測されたラマンスペクトルの変化は宿主細胞の変化のみを反映していることが分かる。
感染後3,6,12,18,24時間での分析を行ったが,感染細胞のうち50-90%だけに変化が観測された。ウイルス濃度は細胞数に比較して高く,レンチウイルスによる遺伝子導入効率も非常に高いことから,遺伝子発現の停止が生じていることが示唆された。レトロウイルスは感染後に一部の細胞で遺伝子発現を停止し,免疫系によって完全に除去されることを防止する能力を持つ。ラマンスペクトルの解析の結果,非感染-感染細胞を判別するスペクトル成分には,DNAと見られるバンドが強く観測され,遺伝子の複製活動が活性化していることを示唆した。蛍光観測では,EGFPの発現は24時間後でも細胞の30%程度に過ぎず,転写されたタンパク質がスペクトル変化の原因では無いことを示唆している。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

アデノウイルスと異なるレンチウイルスに関する結果を得ることができた。ヘルペスウイルスは利用していない。キャプシドタンパク質の精製は試験に成功しており,来年度早々に実験に取りかかる準備ができている。予定していたLC-MSの応用は遅れているが,RT-PCRの導入によりレトロウイルスであるレンチウイルスの分析が容易になった。アデノウイルス,レンチウイルスが共に増殖できる293T細胞導入のアイディアを得ることができたため,LC-MSを利用しなくても,ウイルス感染に対する細胞の反応を研究することができる。

今後の研究の推進方策

HEK293細胞で増殖可能なアデノウイルスと,遺伝子組み込みしか生じないレンチウイルス,レンチウイルスの外殻であるキャプシドタンパク質に対する細胞の反応を比較し,感染に対する細胞の変化をスペクトル変化の相関を明らかにすることを目指す。アデノウイルスとレンチウイルスの比較によって,ウイルス種の違いによる細胞の初期反応の違い,すなわちウイルス種の早期判別の可能性を検証する。初期反応は侵入してきた外殻タンパク質への細胞の反応であり,細胞のウイルス判別能に関する知見が得られる。アデノウイルス,レンチウイルスが共に増殖できる293T細胞を用いる場合,増殖による産物の違いを検出することとなる。従って,ラマン分光分析による判別が可能である場合は,増殖産物の異なるウイルスは全て判別できることを示唆する。レンチウイルスとキャプシドタンパク質を比較した場合,早期のスペクトル変化が細胞の異質ゲノム侵入と異質タンパク質侵入のどちらに対する反応かを知ることができる。

次年度使用額が生じた理由

交付金額ぴったりとなるような物品が無かったため,やむを得ず9円の残金を翌年度に回すこととなった。翌年度に請求する助成金と合わせて計画通りに使用する予定である。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2018

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 4件、 招待講演 2件)

  • [雑誌論文] Application of imaging Raman spectroscopy to study the distribution of Kappa carrageenan in the seaweed Kappaphycus alvarezii2018

    • 著者名/発表者名
      Mahardika Anggara、Susanto A. B.、Pramesti Rini、Matsuyoshi Hiroko、Andriana Bibin Bintang、Matsuda Yusuke、Sato Hidetoshi
    • 雑誌名

      Journal of Applied Phycology

      巻: 31 ページ: 1383~1390

    • DOI

      10.1007/s10811-018-1618-8

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Discrimination analysis of excitatory and inhibitory neurons using Raman spectroscopy2018

    • 著者名/発表者名
      Hashimoto Kosuke、Andriana Bibin B.、Matsuyoshi Hiroko、Sato Hidetoshi
    • 雑誌名

      The Analyst

      巻: 143 ページ: 2889~2894

    • DOI

      10.1039/C8AN00051D

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Early detection of virus infection in live human cells using Raman spectroscopy2018

    • 著者名/発表者名
      Moor Kamila、Terada Yusuke、Taketani Akinori、Matsuyoshi Hiroko、Ohtani Kiyoshi、Sato Hidetoshi
    • 雑誌名

      Journal of Biomedical Optics

      巻: 23 ページ: 1~1

    • DOI

      10.1117/1.JBO.23.9.097001

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Development of Quantitative Analysis Techniques for Saccharification Reactions Using Raman Spectroscopy2018

    • 著者名/発表者名
      Maharadika Anggara、Andriana Bibin B.、Susanto AB、Matsuyoshi Hiroko、Sato Hidetoshi
    • 雑誌名

      Applied Spectroscopy

      巻: 72 ページ: 1606~1612

    • DOI

      10.1177/0003702818779093

    • 査読あり
  • [学会発表] Raman Probe Study of Biogenic Molecules Essential Content on Tempeh2018

    • 著者名/発表者名
      B. B. Andriana, A. Mahardika, A. Maryani, A. Taketani, S. Kato, S. Fujiwara, H. Sato
    • 学会等名
      SCIX2018
    • 国際学会
  • [学会発表] Development of instrument and analytical method for clinical application of Raman spectroscopy2018

    • 著者名/発表者名
      H. Sato, K. Hashimoto, A. Mahardika, K. Moor, M. Ishigaki, A. Taketani, B. B. Andriana, and H. Matsuyoshi
    • 学会等名
      SCIX2018
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Raman Spectroscopy for Analysis Biological Reaction2018

    • 著者名/発表者名
      H. Sato, K. Moor, A. Mahardika, K. Hashimoto, A. Taketani, M. Ishigaki, and B. B. Andriana
    • 学会等名
      ICORS 2018
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Development of instrument and analysis technique for clinical Raman spectroscopy2018

    • 著者名/発表者名
      H. Sato, A. Maharadika, K. Hashimoto, K. Moor, A. Taketani, B. B. Andriana, H. Matsuyoshi, C. Huck, and Y. Ozaki
    • 学会等名
      SPEC 2018
    • 国際学会

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公開日: 2019-12-27  

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