| 研究課題/領域番号 |
17K05921
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
小和田 俊行 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (40584397)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | タンパク質二量化 / フォトクロミック分子 / 光操作 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，タンパク質間相互作用を光照射によって制御可能な機能性小分子の開発を目指している．タンパク質間相互作用に起因する生体機能を任意のタイミングで制御することが可能となれば，複雑な生命システムの理解につながると期待される．そのために，培養細胞内で機能するタンパク質に対して光応答性合成リガンドを結合させ，蛍光顕微鏡観察下において光照射を行い，細胞内，ひいては特定の細胞小器官など，細胞内局所でのタンパク質間相互作用の光制御法の確立を目指す．
当該年度は，前年度に得られていた予備的実験結果である細胞内タンパク質の局在移行実験についてリガンド添加濃度や観察条件などの最適化を行った．具体的には，HEK293T細胞に２種類の蛍光タンパク質融合タンパク質FKBP12(F36V)-mCherry（細胞全体に局在）とHaloTag-EGFP-NLS（核に局在）を発現させ，異なる濃度の光応答性二量化剤（前年度開発）を添加しタンパク質局在移行の程度と速度を比較した．その結果，0.5μM程度の二量化剤添加が有効であることが見いだされた．今後，光照射条件などを更に最適化することで，本研究で目的とする細胞内タンパク質間相互作用の光制御が達成できると考えている．
一方で，細胞イメージングと並行して，光応答性二量化剤の機能改善にも取り組んだ．具体的には，cis体とtrans体間でのFKBP12(F36V)に対する親和性の差をより大きくするために，リンカー構造の導入位置の変更を行った．光応答性や結合親和性の評価については今後検討を行う予定である．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度開発した光応答性二量化剤を用いて，培養細胞を用いた生細胞内タンパク質局在移行の実験を行い，二量化剤の添加量などの条件検討を達成した．しかしながら，光照射条件の最適化まで到達できておらず，未だタンパク質間相互作用の光制御技術を確立できたとは言えない．そこで，当初の予定から実施期間を１年間延長し，本研究達成を目指す．
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| 今後の研究の推進方策 |
培養細胞内に蛍光タンパク質融合タンパク質FKBP12(F36V)とHaloTag-EGFP-NLSを発現させ，既に開発済みの光応答性リガンドを添加し，生細胞内においてタンパク質二量体化を誘起する．さらに顕微鏡観察中に光照射を行い，タンパク質の局在移行の程度・速度を効率よく制御できる条件（照射光の波長・照射時間）を検討する．タンパク質二量化の脱二量化の可逆性についても検証を行う．また，本手法の適用範囲を示すために，HaloTagを核以外の細胞小器官（ERやミトコンドリアなど）に局在化させ，同様の実験を行う．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画していた哺乳類培養細胞を用いた評価系の立ち上げ，ならびに光照射系の立ち上げに想定以上に時間を要した．そのため，開発したプローブの機能評価にはさらなる時間が必要と判断し，当初計画していた補助事業期間を１年間延長することとなったため．細胞培養や蛍光イメージングにかかる消耗品費，ならびに有機合成と化合物の物性評価にかかる消耗品費，成果報告のための旅費，としての使用を予定している．
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