グルコシド-3-脱水素酵素オペロン中の機能未知のタンパク質の解析

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K05924
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 津川 若子 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80376871)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: グルコシド 3-脱水素酵素 / シトクロムc / 電子受容体 / Halomonas / Rhizobium radiobacter

研究実績の概要

2017年度から継続してCYTcについてとしての機能を検討した。CYTcは遊離のシトクロムcでありG3DHのsubunitI,II複合体と外部電子受容体との間に働くメディエータである。そこで電子をもらう相手である、デヒドロゲナーゼに対する特異性を評価する目的で、FADを補酵素とするAspergillus flavus由来グルコース脱水素酵素(AflGDH)とCYTcを混合し、基質添加後の吸収スペクトルを計測した。グルコースを添加するとヘムの還元に相当する551nmのピークが時間とともに増加したことから、CYTcはAflGDHから電子を受け取ることが明らかになった。しかしVmaxは10mU/mg程度であり、CYTc～G3DHsubunitI,II複合体間のVmax40U/mgと比較すると1/4000であった。GDHの立体構造およびAflGDHが鉄イオウクラスタを持たないための酸化還元電位の違いによるものと考えられる。
触媒サブユニットであるSubunit Iとシャペロン様タンパク質といわれるSubunitIIの相互作用部位について検討する予定だったが立体構造既知のホモログがないことから部位の特定は困難だった。そこでSubunit I,II間相互作用の互換性について検討した。Halomonas sp. α15　(α)、Rhizobium radiobacter　(R)　由来G3DHのそれぞれのsubunit I,IIを入れ替えたところ活性はRhizobium(I)－Rhizomium(II) > Halomonas(I)-Halomonas (II)＞＞Rhizobium(I) -Halomonas (II) であり、Halomonas(I)- Rhizomium(II) は活性を示さなかった。これらのことから、subunit I, IIは互換性があると考えられた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

触媒サブユニットであるSubunit Iとシャペロン様タンパク質といわれるSubunitIIの相互作用部位について検討する予定だったが立体構造既知のホモログがないことから部位の特定が困難だったため。

今後の研究の推進方策

1)SubunitIIの機能評価
SubunitII の、Iに対するシャペロン機能を評価する。尿素等で変性させたG3DHと補酵素であるFAD、SubunitII を共存させ、リフォールディングに対する効果を検証する。組換え発現の場合、通常はSubunitI とSubunitII がともに発現し、精製時もある程度結合を保持したままであるため、ここではHis タグを付加したSubunit Iを用い、ニッケルキレートクロマトグラフィーでの精製時に変性剤を用いてSubunitII のみを洗い落とし、SubunitI のみを得る。これを別途単独で発現させたSubunitII と合わせ上記検証を行う。
またG3DHは精製中や保存中に活性を徐々に失う。これはSubunitIIの解離によるものであろうといわれているがその関連は明確ではない。そこで、SubunitIIのG3DHの安定性への寄与について検討する。すなわち、SubunitIIを単独発現させ、精製G3DHに添加し保存安定性を評価する。
2)直接電子移動型G3DHの構築
鉄硫黄クラスターに近く、G3DH 表面にあるアミノ酸残基を複数候補として選びシステインに置換し、活性が保たれていることを計測した上でマレイミド基-NTA 二架橋性試薬をリンカーとして、G3DH のシステイン残基にリンカーを介して、ヒスチジンタグをつけたCYTcを架橋する。もっとも反応性の良い連結位置を決定し、金電極上にSelf　Assembly Monolayer（SAM）を形成させG3DH-モノヘムシトクロムタンパク質連結体を添加して固定する。クロノアンペロメトリー法による直接電子移動能を計測する。

次年度使用額が生じた理由

2019年度に遺伝子関連実験および、電極関連実験を多数行う見込みであるため。

研究成果

• [学会発表] Elucidation of the intra- and inter-molecular electron transfer pathways of glucoside 3-dehydrogenasefrom Rhizobium radiobacter (2018)
  • 著者名/発表者名: 津川若子
  • 学会等名: The 15th Japan-China-Korea Joint Symposium on Enzyme Engineering.
  • 国際学会