| 研究実績の概要 |
グルコシド-3-脱水素酵素(G3DH)は、六炭糖のC-3 位を酸化する特異な部位特異性を有することから糖の計測、誘導体の合成など応用研究が進められてきたがタンパク質のサブユニット構造や機能に関する情報は乏しかった。G3DHの触媒サブユニットSubIには補酵素FAD 結合配列の他に鉄硫黄クラスタ様の領域があること、SubIを含むオペロンには発現に必須だが機能不明の17.3kDa のSubIIをコードするORF2があること、オペロン下流に12.6kDa のシトクロム様配列を有すORF3があることは既知だが機能は不明だった。
本研究ではG3DHの SubI,IIおよびORF3にコードされるタンパク質の機能を明確にし、G3DH のエンジニアリングの指針を得ることを目的とした。これまでにsubIの3Fe4S型の鉄硫黄クラスタの存在,ORF3がシトクロムcであり基質の酸化により電子が鉄硫黄クラスタからシトクロムcへと授受されることを明らかにした。
2019年度は今後のG3DHの結晶構造解析を目指し、組み換えsubI,II複合体の調製を試みた。当初計画していたsubIの立体構造モデリングが、構造既知のBurkholderia cepaciaGDH(BcGDH)と部分的に配列が大きく異なることから困難だったためである。その結果subI,II複合体の1/3が精製中に解離してしまうことが解った。そこで安定な複合体の獲得、当初目的のsubI,II界面のアミノ酸残基を明らかにする目的とから、subI,II間へのジスルフィド結合の導入を試みた。BcGDHは触媒サブユニット、ヒッチハイカーサブユニット間のジスルフィド結合により高い安定性を示すことから、subIに1か所、subII に1か所のアミノ酸残基をシステイン置換した変異体11種を評価したが安定性が向上した変異体は得られず界面の残基は不明だった。
|
