| 研究課題/領域番号 |
17K05931
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
横山 泰範 名古屋大学, 工学研究科, 助教 (80402486)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 生体材料 / 光受容タンパク質 / 工業応用 / 固定化 / 疑似生体環境 |
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| 研究実績の概要 |
光機能性膜タンパク質・バクテリオロドプシン(bR)を用いた新規光デバイス開発を目指し、生体分子が本来の機能を発揮することができる固体環境の実現、すなわち生体環境疑似固定化法の創製に取り組むとともに、凍結・融解法によるポリビニルアルコール(PVA-FT)ゲル固体試料中での紫膜積層について機構解明を目的として研究を行ってきた。
PVA溶液中に紫膜を分散すると、紫膜間に約20 nm周期の等方的な規則構造を形成する一方、塩添加により消失することをこれまでに見出してきたが、その機構は不明であった。規則構造形成のためには紫膜間に引力と斥力が釣り合った状態になっていると考え、引力項と斥力項それぞれについて検討を行った。つまり、引力項としては紫膜と高分子鎖との間の何らかの相互作用によるものであると考えられるので、PVA濃度を変化させるだけではなく、PVA以外の親水性高分子中に紫膜を分散させて周期構造の有無を観測した。一方、斥力項としては紫膜表面間の静電斥力が疑われるため、価数の異なる塩の影響や、酵素処理により表面電荷を減じた紫膜を調製し、紫膜間周期構造を比較検討した。
紫膜間の周期構造について検討した結果、PVA濃度の増加とともに周期が短くなることが明らかとなった。また、親水性高分子・ポリエチレングリコール(PEG)中でも紫膜間規則構造は形成され、PEG濃度増加に伴い紫膜間距離が減少した。これらのことから、紫膜間の周期構造は紫膜とPVAの特異的な相互作用によるものではなく、高分子溶液中においてコロイド粒子間に働く高分子濃度に依存した引力であることが強く示唆された。一方斥力項については、紫膜間の規則構造は塩の種類に依らず静電相互作用の及ぶ距離(Debye長)と非常に良い相関があるだけではなく、酵素処理紫膜においてさらに膜間距離が減少したことから、静電斥力が支配的であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度初頭に試料作製・保管に必須の冷凍庫が故障し、代替品を購入したため、生体環境疑似固定媒体の探索において数を絞らざるを得ない状況に陥った。一般に物理架橋ゲルは力学強度が低く熱により容易にゲルが融解するので、共有結合による架橋点をもつ化学架橋ゲルが望ましい。ゲルネットワーク構造と紫膜積層の関係を考える上で、同一の固定化媒体で異なるゲルネットワーク構造を作製できるのは利点であり、網目状や空孔構造を形成可能な化学架橋アクリルアミドゲルを選定した。アクリルアミドゲルは主剤（アクリルアミド）モノマーと架橋剤（メチレンビスアクリルアミド）モノマーのラジカル反応により形成され、nmサイズの均質な網目構造を有する。しかしながら、氷点下においてゲル構造形成を行うと大きな多孔質なネットワーク構造になり、主剤と架橋剤の比を変えることでも不均質・多孔質なネットワーク構造のゲルとなる。そこで、これら氷点下で得られるクライオゲル及び常温多孔質ゲルを紫膜存在下において作製し、紫膜積層について常温均質ゲルと比較検討した。
常温均質ゲルで固定化した紫膜について、可視円2色性(CD)測定により紫膜積層を検討したところ、紫膜の積層は見られなかった。一方、多孔質ゲルネットワーク構造を形成するクライオゲルについては散乱の影響が大きく透過分光測定に適さなかった。常温多孔質ゲルについては、ゲル化した直後では紫膜積層は見られなかったが、凍結・融解過程を2-3回繰り返すことにより、紫膜積層を示唆する可視CDスペクトルが得られた。
アクリルアミドゲルで固定化した紫膜に対し、高温での評価を行った。80℃以下で融解した物理架橋ゲルに対し、化学架橋アクリルアミドゲルは90℃でも融解せず、溶液中と同じくbR高温変性中間状態へ遷移した。より高温でもゲル構造が溶けず、固体中での光書込みが可能であることを実証された。
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| 今後の研究の推進方策 |
アクリルアミドゲルによる固定化紫膜試料では、不均質・多孔質ゲルの条件で作製し、凍結・融解過程を経ることにより紫膜の積層化が示唆された。しかしながら、この固体試料においてゲルネットワーク構造がどうなっているか、全く情報がない。このため、今年度は顕微鏡観察の手法を取り入れ、固体試料中の紫膜やゲル構造について情報を得る。
固体試料作製については、疑似生体環境を構築する方向でさらに研究を進める。具体的には、ハイドロゲルを中心に、物理架橋・化学架橋ゲルについて幅広く探索する。また、多孔質構造を持つゲルについても検討を行い、場合によってはハイドロゲルにこだわらず挑戦する。新たに作製した固体試料については、引き続き過渡吸収測定によるレチナール光反応性、可視円2色性測定による紫膜積層、小角X線散乱測定による紫膜間の規則構造について検討する。
また、固定する対象について、紫膜から再構成膜への転換を図る。これは、紫膜中ではbRの2次元結晶は80℃以上でなければ融解せず、90℃以上になると熱変性のリスクが無視できないためである。このため、もっと低温において2次元結晶の融解可能な平面膜の作製に取り組み、これまで試してきた媒体により固定化を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成30年末、研究推進に必要不可欠な純水製造装置に不調が生じ、ほどなく修理不能な状態に陥った。この時点での研究費の残額では新機種購入には不足であったため、やむを得ず残額をできる限り使用せず次年度使用額とした。この使用計画としては、次年度初頭に純水装置を購入する予定である。
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