革新的抗体設計技術の創出

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K06931
• 研究機関: 静岡県立大学
• 研究代表者: 伊藤 創平 静岡県立大学, 食品栄養環境科学研究院, 准教授 (70372836)
• 研究分担者: 中野 祥吾 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (80748541)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 人工抗体 / 人工酵素 / アルカリフォスファターゼ / VHH / 配列のヒト化 / コンセンサス設計 / 機械学習 / 祖先型設計

研究実績の概要

配列解析より設計した、ラマ型人工設計VHHであるFcAb1およびFcAb2は、ラマ型VHHと比較し20%程度の新規性を持っていた。しかし、FcAb1およびFcAb2は、沈殿しやすい、抗原認識部位を導入すると生産性が下がるなどの欠点を持っていた。この原因を探るため、ゲルろ過等やNative-pageで分子量の分布を見ると、高次構造がヘテロであった。ペリプラズムに発現させたり、Gro-EL/ES、DnaK-DnaJなどの分子シャペロンによっては、この性質や生産性はあまり改善しなかった。そこで、人工設計に用いるパラメーターの改良、設計過程の可視により設計に用いる配列を調整する事で、設計精度の向上を図った。また、設計に用いる配列データを人由来とすることで、配列をヒト化したVHHを、改良したプログラムで設計したところ、生産量が1.5~2倍に向上、TNF-αの抗原認識部位を移植したところ、移植元の抗体と同等の結合能を、ITC解析では示した。よって、配列をヒト化した上で、ラマ型VHHと同様に単鎖のみで抗原に結合する人工抗体の設計に成功したといえる。ただし、その１次配列は、米ベンチャー企業が特許出願済の配列と酷似していた。高等生物の抗体は非常に多くの企業や研究者が研究し、多数の特許が存在するため、特に配列をヒト化した場合、1次配列自体の新規性を担保するのは難しいが、ラクダVHHのような性質をもつ単鎖抗体をヒトの配列で設計できたことには意味があると考える。また、抗体を検出する時に利用するアルカリフォスファターゼ等、検出用の酵素の高機能化を目的として、人工設計酵素の設計を行ない、一部の人工酵素で活性が有る形で高発現できることを確認した。H30年度は、改良されたプログラムを用いた論文を含めると、8報の論文と１つの特許出願、静岡テックプランコンテストで優勝する等の業績を果たした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

H29年に前倒しした研究を含め、研究計画は概ね順調に進んでいる。改良されたプログラムにより再設計およびヒト化したFcAbは、プロトタイプに比べると、生産性および物性が大きく向上していた。ペリプラズムへの発現や分子シャペロンの効果がなかったのは予期していなかったが、余分なシグナル等をつけずに、細胞内で高発現するVHHは、融合タンパク質を調整する目的ではむしろ都合がよいと考えいる。

今後の研究の推進方策

抗体を検出する際に用いられている酵素の設計・改良に引き続き挑戦する。大腸菌で高生産で高活性であり、抗体との融合蛋白質を菌体内で生合成することをめざす。また、scFvを利用している研究者は未だに多いため、scFvを配列解析により設計もしくは改良可能か挑戦する。

研究成果

• [雑誌論文] Human TRPA1 activation by terpenes derived from the essential oil of daidai, Citrus aurantium L. var. daidai Makino (2019)
  • 著者名/発表者名: Terada Yuko、Yamashita Rie、Ihara Nozomi、Yamazaki-Ito Toyomi、Takahashi Yuma、Masuda Haruka、Sakuragawa Satoshi、Ito Sohei、Ito Keisuke、Watanabe Tatsuo
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 巻: 10 ページ: 1～8
  • DOI: 10.1080/09168451.2019.1611405
• [雑誌論文] Following the Evolutionary Track of a Highly Specific L-Arginine Oxidase by Reconstruction and Biochemical Analysis of Ancestral and Native Enzymes (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakano Shogo、Niwa Masazumi、Asano Yasuhisa、Ito Sohei
  • 雑誌名: Applied and Environmental Microbiology 巻: 10 ページ: 00459
  • DOI: 10.1128/AEM.00459-19
• [雑誌論文] Development of an Analysis Toolkit, AnalysisFMO, to Visualize Interaction Energies Generated by Fragment Molecular Orbital Calculations (2018)
  • 著者名/発表者名: Tokiwa Takaki、Nakano Shogo、Yamamoto Yuta、Ishikawa Takeshi、Ito Sohei、Sladek Vladimir、Fukuzawa Kaori、Mochizuki Yuji、Tokiwa Hiroaki、Misaizu Fuminori、Shigeta Yasuteru
  • 雑誌名: Journal of Chemical Information and Modeling 巻: 59 ページ: 25～30
  • DOI: 10.1021/acs.jcim.8b00649
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of soybean peptide leginsulin variants in different cultivars and their insulin-like activities (2018)
  • 著者名/発表者名: Hashidume Tsutomu、Sakano Taiken、Mochizuki Ayaka、Ito Keisuke、Ito Sohei、Kawarasaki Yasuaki、Miyoshi Noriyuki
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 8 ページ: 16847
  • DOI: 10.1038/s41598-018-35331-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dual conformation of the ligand induces the partial agonistic activity of retinoid X receptor α (RXRα) (2018)
  • 著者名/発表者名: Miyashita Yurina、Numoto Nobutaka、Arulmozhiraja Sundaram、Nakano Shogo、Matsuo Naoya、Shimizu Kanade、Shibahara Osamu、Fujihara Michiko、Kakuta Hiroki、Ito Sohei、Ikura Teikichi、Ito Nobutoshi、Tokiwa Hiroaki
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 593 ページ: 242～250
  • DOI: 10.1002/1873-3468.13301
  • 査読あり
• [雑誌論文] Improvement of ST0452 N-Acetylglucosamine-1-Phosphate Uridyltransferase Activity by the Cooperative Effect of Two Single Mutations Identified through Structure-Based Protein Engineering (2018)
  • 著者名/発表者名: Honda Yuki、Nakano Shogo、Ito Sohei、Dadashipour Mohammad、Zhang Zilian、Kawarabayasi Yutaka
  • 雑誌名: Applied and Environmental Microbiology 巻: 84 ページ: e02213-18
  • DOI: 10.1128/AEM.02213-18
  • 査読あり
• [雑誌論文] Computational Molecular Docking and X-ray Crystallographic Studies of Catechins in New Drug Design Strategies (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakano Shogo、Megro Shin-ichi、Hase Tadashi、Suzuki Takuji、Isemura Mamoru、Nakamura Yoriyuki、Ito Sohei
  • 雑誌名: Molecules 巻: 23 ページ: 2020～2020
  • DOI: 10.3390/molecules23082020
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] In Vitro and In Silico Studies of the Molecular Interactions of Epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG) with Proteins That Explain the Health Benefits of Green Tea (2018)
  • 著者名/発表者名: Saeki Koichi、Hayakawa Sumio、Nakano Shogo、Ito Sohei、Oishi Yumiko、Suzuki Yasuo、Isemura Mamoru
  • 雑誌名: Molecules 巻: 23 ページ: 1295～1295
  • DOI: 10.3390/molecules23061295
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Benchmark Analysis of Native and Artificial NAD+-Dependent Enzymes Generated by a Sequence-Based Design Method with or without Phylogenetic Data (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakano Shogo、Motoyama Tomoharu、Miyashita Yurina、Ishizuka Yuki、Matsuo Naoya、Tokiwa Hiroaki、Shinoda Suguru、Asano Yasuhisa、Ito Sohei
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 57 ページ: 3722～3732
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.8b00339
  • 査読あり
• [雑誌論文] Binding of Catechins to Staphylococcal Enterotoxin A (2018)
  • 著者名/発表者名: Shimamura Yuko、Utsumi Mio、Hirai Chikako、Nakano Shogo、Ito Sohei、Tsuji Ai、Ishii Takeshi、Hosoya Takahiro、Kan Toshiyuki、Ohashi Norio、Masuda Shuichi
  • 雑誌名: Molecules 巻: 23 ページ: 1125～1125
  • DOI: 10.3390/molecules23051125
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] The extreme N-terminus of SLAM determines the fate of humans and monkeys against canine distemper virus infection (2018)
  • 著者名/発表者名: Fumio Seki, Hideo Fukuhara, Yuta Yamamoto, Sundaram Alulmozhiraja, Shogo Nakano, Sohei Ito, Kazue Ohishi, Tadashi Maruyama, Shigeru Morikawa, Ryoji Yamaguchi, Hiroaki Tokiwa, Katsumi Maenaka, Makoto Takeda
  • 学会等名: The 17th Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • 国際学会
• [学会発表] How to design artificial protein surpassing native enzyme function similar to Design and multidisciplinary analysis of artificial L-threonine 3-dehydrogenase (2018)
  • 著者名/発表者名: Shogo Nakano, Tomoharu Motoyama, Yurina Miyashita, Yuki Ishizuka, Naoya Matsuo, Hiroaki Tokiwa, Suguru Shinoda, Yasuhisa Asano, Sohei Ito
  • 学会等名: ASBMB Experimental Biology
  • 国際学会
• [学会発表] Discovery of novel monomeric L-threonine 3-dehydrogenase and elucidation of product release mechanism (2018)
  • 著者名/発表者名: Tomoharu Motoyama, Shogo Nakano, Yuta Yamamoto, Hiroaki Tokiwa, Yasuhisa Asano, Sohei Ito
  • 学会等名: ASBMB Experimental Biology 2018
  • 国際学会
• [学会発表] What is the origin of partial agonist activity of CBt-PMN for hRXRα? (2018)
  • 著者名/発表者名: Kanade Shimizu, Yurina Miyashita, Yuta Yamamoto, Naoya Matsuo, Shogo Nakano, Sohei Ito, Nobutaka Numoto, Nobutoshi Ito, Hiroki Kakuta, Hiroaki Tokiwa
  • 学会等名: ASBMB Experimental Biology 2018
  • 国際学会
• [学会発表] Computational design and molecular mechanism in oligomerization of C-terminal binding protein 2 (2018)
  • 著者名/発表者名: Yurina Miyashita, Naoya Matsuo, Yuta Yamamoto, Shogo Nakano, Sohei Ito, Nobutaka Numoto, Teikichi Ikura, Nobutoshi Ito, Motohiro Sekiya, Hitoshi Shimano, and Hiroaki Tokiwa
  • 学会等名: ASBMB Experimental Biology 2018
  • 国際学会
• [学会発表] Crystal structure of the tetrameric ligand binding domain of RXRalpha complexed with a novel synthetic partial agonist. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yurina Miyashita, Nobutaka Numoto, Sundaram Arulmozhiraja, Shogo Nakano, Naoya Matsuo, Kanade Shimizu, Osamu Shibahara, Michiko Fujiwara, Hiroki Kakuta, Sohei Ito, Teikichi Ikura, Nobutoshi Ito, Hiroaki Tokiwa
  • 学会等名: The 56th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • 国際学会
• [学会発表] Role for the extreme N-terminus of SLAM in determination of the moribillivirus host range (2018)
  • 著者名/発表者名: Fumio Seki, Hideo Fukuhara, Yuta Yamamoto, Sundaram Alulmozhiraja, Shogo Nakano, Sohei Ito, Kazue Ohishi, Tadashi Maruyama, Shigeru Morikawa, Ryoji Yamaguchi, Hiroaki Tokiwa, Katsumi Maenaka, Makoto Takeda
  • 学会等名: The 66th Annual Meeting of the Japansese Society of Viroglogy
  • 国際学会
• [学会発表] Molecular basis of ligand interaction of GPR40/GPR120 based on FMO calculations with multiple sequence analysis (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, Y., Sladek, V., Arulmozhiraja, S., Hayamizu, K., Nakano, S., Ito, S., Watanabe, Y., Yamada, S., Tokiwa, H.
  • 学会等名: 11th Triennial Congress of the World Association of Theoretical and Computational Chemists
  • 国際学会
• [学会発表] Elucidating coevolution mechanism of morbillivirus with mammals using the fourth revolutionary method based on a novel protein multiple sequence method (2018)
  • 著者名/発表者名: Matsuo, N., Nakano, S., Ito, S., Seki, F., Takeda, M., Tokiwa, H.
  • 学会等名: The 16th Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • 国際学会
• [学会発表] Thermostability enhancement of L-glutamate oxidase from Streptomyces sp. NT1 by the artificial protein design (2018)
  • 著者名/発表者名: Yuka Hayashi, Masaya Nakamura, Shin-ichi Sakasegawa, Shogo Nakano, Sohei Ito, Yasuhisa Asano, Daisuke Sugimori
  • 学会等名: 日本生物工学会 北日本支部 福島シンポジウム
• [学会発表] アミノ酸の配列データみを用いた高機能化酵素人工設計 (2018)
  • 著者名/発表者名: 本山智晴、中野祥吾、宮下由里奈、石塚由貴、松尾直也、常盤広明、浅野泰久、伊藤創平
  • 学会等名: 第19回ライフサイエンスシンポジウム
• [学会発表] 人工抗体設計技術の構築 ~ラクダVHH抗体のヒト化とその応用~ (2018)
  • 著者名/発表者名: 三村健太、中野祥吾、伊藤創平
  • 学会等名: 第19回ライフサイエンスシンポジウム
• [学会発表] Streptomyces sp .NT1株由来L-グルタミン酸オキシダーゼの人工タンパク質設計による耐熱性の向上 (2018)
  • 著者名/発表者名: 林優花、中村誠彌、酒瀬川信一、中野祥吾、伊藤創平、浅野泰久、杉森大助
  • 学会等名: 日本農芸化学会大会
• [学会発表] 新規単量体型L-スレオニン脱水素酵素の発見と生成物脱離機構の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 本山智晴、中野祥吾、山本雄大、常盤広明、浅野泰久、伊藤創平
  • 学会等名: 日本農芸化学会大会
• [学会発表] 祖先型設計法を用いたL-アルギニン酸化酵素の基質特異性の改変と熱安定化 (2018)
  • 著者名/発表者名: 丹羽正純、中野祥吾、浅野泰久、伊藤創平
  • 学会等名: 日本農芸化学会大会
• [学会発表] 葉緑体「光スイッチ」を用いた物質生産に向けた活性型抗体可変断片Fvの作製 (2018)
  • 著者名/発表者名: 深澤斗希也、清水正則、伊藤創平、小林裕
  • 学会等名: 日本農芸化学会大会
• [学会発表] イヌジステンパーウイルスの株間の感染性の違いに着目したウイルスタンパク質 と受容体の相互作用解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 松尾 直也, 關 文緒, 中野 祥吾, 伊藤 創平, 前仲 勝実, 竹田 誠, 常盤 広明
  • 学会等名: 日本薬学会大会
• [学会発表] hRXRα リガンド CBt-PMN のパーシャルアゴニスト活性の起源は何か？ (2018)
  • 著者名/発表者名: 清水 奏, 宮下 由里奈, 松尾 直也, 中野 祥吾, 伊藤 創平, 沼本 修孝, 伊倉 貞吉, 伊藤 暢聡, 加来田 博貴, 常盤 広明
  • 学会等名: 日本薬学会大会
• [学会発表] NADH 依存型脂質代謝関連蛋白質の新規分子設計に基づく分子基盤 (2018)
  • 著者名/発表者名: 宮下 由里奈, 山本 雄大, 中野 祥吾, 伊藤 創平, 沼本 修孝, 伊倉 貞吉, 伊藤 暢聡, 関谷 元博, 島野 仁, 常盤 広明
  • 学会等名: 日本薬学会大会
• [学会発表] 第四次革新的手法による難解析性タンパク質の構造および機能解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 松田 留理子, 宮下 由里奈, 中野 祥吾, 伊藤 創平, 島野 仁, 常盤 広明
  • 学会等名: 日本薬学会大会
• [学会発表] 構造および配列を基盤とした遊離脂肪酸受容体 (FFAR1/FFAR4)と PUFA との相互 作用解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山本 雄大, Sundaram ARULMOZHIRAJA, Vladimir SLADEK, 速水 耕介, 韓 力, 辻 智子, 中野 祥吾, 伊藤 創平, 渡邊 泰雄, 山田 静雄, 常盤 広明
  • 学会等名: 日本薬学会大会
• [学会発表] 核内受容体転写因子複合体におけるRXRαパーシャルアゴニストのPPI制御能に関する構造生物学,熱化学,および理論化学的解 (2018)
  • 著者名/発表者名: 清水奏、宮下由里奈、中野祥吾、伊藤創平、沼本修孝、伊倉貞吉、伊藤暢聡、加来田博貴、常盤広明
  • 学会等名: 創薬懇話会
• [学会発表] Streptomyces sp. NT1 株由来 L-グルタミン酸オキシダーゼのフルコンセンサス設計による耐熱性の向上 (2018)
  • 著者名/発表者名: 齋藤 貴広, 久保田 瞳, 林 優花, 中野 祥吾, 伊藤 創平, 浅野 泰久, 酒瀬川 信一, 杉森 大助
  • 学会等名: 第70回日本生物工学会大会
• [学会発表] サルならびにヒトのイヌジステンパーウイルスに対する感受性を決めるSLAM遺伝子 (2018)
  • 著者名/発表者名: 關文緒、福原秀樹、山本雄大、Sundaram Alulmozhiraja、中野祥吾、伊藤創平、大石和恵、丸山正、森川茂、山口良二、常盤広明、前仲勝実、竹田誠
  • 学会等名: 変異第90回日本遺伝学会
• [学会発表] 含窒素ヘテロ環式化合物の酵素法による合成への展開 (2018)
  • 著者名/発表者名: 本山智晴、中野祥吾、山本雄大、常盤広明、浅野泰久、伊藤創平
  • 学会等名: 日本生物工学会中部支部例会
• [学会発表] ウンベリフェロン構造を有する蛍光性レチノイドX受容体リガンドの創出と結合試験への応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山田翔也, 藤原美智子, 渡邉将貴, 川_真由, 中野祥吾, 伊藤創平, 加来田博貴
  • 学会等名: 第36回メディシナルケミストリーシンポジウム
• [学会発表] レチノイドX受容体ホモダイマー選択的アンタゴニストの創出 (2018)
  • 著者名/発表者名: 渡邉将貴, 中山真理子, 藤原美智子, 西井緑, 槇島誠, 川_真由, 中野祥吾, 伊藤創平, 加来田博貴
  • 学会等名: 第36回メディシナルケミストリーシンポジウム
• [学会発表] X 線結晶構造及び相互作用解析に基づく蛍光性 RXRα アゴニスト作用機序の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 川_真由, 中野祥吾, 本山智晴, 山田翔也, 渡邉将貴, 藤原美智子, 常盤広明, 加来田博貴, 伊藤創平
  • 学会等名: 第36回メディシナルケミストリーシンポジウム
• [学会発表] 新規代謝センサー分子CtBP2のアミノ酸配列に基づく分子設計と構造・物性評価 (2018)
  • 著者名/発表者名: 宮下 由里奈, 山本 雄大, 中野 祥吾, 伊藤 創平, 沼本 修孝, 伊倉 貞吉, 伊藤 暢聡, 関谷 元博, 島野 仁, 常盤 広明
  • 学会等名: 第36回メディシナルケミストリーシンポジウム
• [学会発表] 配列を基盤としたバイオインフォマティックスによるモルビリウイルスと感染哺乳動物との共進化に関する理論的研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 樋口 玲爾、關 文緒、中野 祥吾、伊藤 創平、丸山 正、大石 和恵、竹田 誠、常盤 広明
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Rational designs of artificial viral proteins using a novel multiple sequence analysis (2018)
  • 著者名/発表者名: 松尾直也・樋口玲爾・中野祥吾・伊藤創平・關文緒・竹田誠・常盤広明
  • 学会等名: 第65回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] 第四次革新的手法を用いたインフルエンザHA様人工タンパク質の理論設計 (2018)
  • 著者名/発表者名: 松尾直也・樋口玲爾・中野祥吾・伊藤創平・常盤広明
  • 学会等名: 創薬懇話会2017
• [備考] 静岡テックプラングランプリで最優秀賞
  • URL: https://www.u-shizuoka-ken.ac.jp/news/20180713/
• [備考] 日本学術振興会特別研究員に内定
  • URL: https://www.u-shizuoka-ken.ac.jp/news/20181031/
• [備考] 茶学術研究会講演会で奨励賞
  • URL: https://www.u-shizuoka-ken.ac.jp/news/20190325-1/
• [備考] 静岡ライフサイエンスシンポジウムで受賞
  • URL: https://www.u-shizuoka-ken.ac.jp/news/20190305-1/
• [産業財産権] 新規なＬ－アミノ酸オキシダーゼ及びＤ－アミノ酸又はその誘導体の製造方法 (2019)
  • 発明者名: 中野 祥吾, 南野優季、伊藤 創平
  • 権利者名: 中野 祥吾, 南野優季、伊藤 創平
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2019-62177
• [産業財産権] 糖鎖結合性一本鎖抗体の改変 (2018)
  • 発明者名: 隅田 泰生、常盤 広明、中野 祥吾、伊藤 創平、他
  • 権利者名: 隅田 泰生、常盤 広明、中野 祥吾、伊藤 創平、他
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2018-93399
• [産業財産権] 2-O-SULFATION ENZYME MUTANT AND 3-O-SULFATION ENZYME MUTANT, AND METHOD FOR USING SAME (2018)
  • 発明者名: TSUJI, C., MIHARA, Y., ITO, S. 他
  • 権利者名: TSUJI, C., MIHARA, Y., ITO, S. 他
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2018/033897
  • 外国
• [産業財産権] ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法 (2017)
  • 発明者名: 辻 ちひろ、三原 康博 、中野 祥吾、本山 智晴、伊藤 創平
  • 権利者名: 辻 ちひろ、三原 康博 、中野 祥吾、本山 智晴、伊藤 創平
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2017/030998
  • 外国