2017 年度実施状況報告書

1細胞メチル化DNA検出法の開発と血中循環腫瘍細胞の簡易検出法への展開

研究課題

研究課題/領域番号	17K06933
研究機関	東京工科大学
研究代表者	吉田亘東京工科大学, 応用生物学部, 講師 (10599806)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード	グアニン四重鎖DNAクラスター / 全ゲノム増幅 / 次世代シークエンサー / DNAメチル化
研究実績の概要	本研究は1細胞レベルでがん関連遺伝子のメチル化レベルを直接測定する方法を開発することを目的としている。これまでにグアニン四重鎖(G4) DNAがメチル化されるとその構造が安定化すること利用し、PCR増幅効率を測定するだけで標的遺伝子のメチル化レベルを測定できる方法を開発している。そこで本研究では細胞を直接PCR溶液に加え定量PCRを行うことにより癌関連遺伝子のメチル化レベルを測定する方法を開発する。本年度は本検出法の標的となるG4 DNA形成配列を複数含む領域(G4 cluster)をヒトゲノム中から網羅的に同定することを目的とした。これまでにPCR溶液にグアニン四重鎖DNAに特異的に結合する化合物7OTDを添加すると、鋳型となるDNAがG4構造を形成する場合PCRが阻害されることが報告されている。そこで、ヒトゲノムDNAに7OTDを添加し、Whole Genome Amplification (WGA)反応を行えば、ヒトゲノムDNAにおいてG4 cluster領域でWGA反応が阻害されると想定した。つまり、得られたWGA反応産物を次世代シークエンサーで解析し、WGA反応が阻害されているゲノム領域を同定すれば、ヒトゲノムDNA中で形成されるG4 clustersを網羅的に同定できると想定した。実際に7OTD存在下でヒトゲノムDNAをWGAで増幅し、それを次世代シークエンサーで解析した結果、9,651箇所のG4 clustersを同定することに成功した。さらに、その内3,766 G4 clustersは近傍に転写開始点を含み、95遺伝子ががん関連遺伝子であることが明らかになった。つまり、これらがPCRでメチル化レベルを測定する方法の標的遺伝子領域となることが明らかになった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由本年度は本検出法の標的となるG4 DNA形成配列を複数含む領域(G4 cluster)をヒトゲノム中から網羅的に同定することを目的とした。これまでにPCR溶液にグアニン四重鎖DNAに特異的に結合する化合物7OTDを添加すると、鋳型となるDNAがG4構造を形成する場合PCRが阻害されることが報告されている。そこで、ヒトゲノムDNAに7OTDを添加し、Whole Genome Amplification (WGA)反応を行えば、ヒトゲノムDNAにおいてG4 cluster領域でWGA反応が阻害さると想定した。実際に7OTD存在下でヒトゲノムをWGAで増幅し、そのWGA効率をPCRで解析した。G4構造形成配列を含む遺伝子としてc-MYC, c-KIT, BCL2, VEGFAを、G4構造形成配列を含まない遺伝子としてMBD3L3, CD4, CNDP2, SOD1を標的としてPCRを行った。その結果、7OTDを加えてWGAを行うと、G4構造形成配列を含む遺伝子特異的にWGA増幅効率が低下することが示された。そこで、このWGA産物のDNA配列をIllumina HiSeq X10 (the paired-end mode: 150bp×2)を用いて解析した。その結果、平均35 coverageのデータが得られた。全ゲノムに対して10kbp windowごとのリード数をカウントした結果、7OTDを加えた場合に特異的にリード数が減少している領域として9,651箇所のゲノム領域を同定した。つまり、9,651か所のG4 clustersを同定することに成功した。さらに、その内3,766 G4 clustersは近傍に転写開始点を含むことから、これらがメチル化測定のために標的になることが示された。
今後の研究の推進方策	これまでの研究でヒトゲノムDNA中から9,651箇所のG4 clustersを同定し、その内3,766 G4 clustersは転写開始点近傍に存在することを明らかにしている。さらに、その内95遺伝子ががん関連遺伝子であることも明らかにしている。つまり、これらがPCRでメチル化レベルを測定する方法の標的遺伝子領域となる。今後これらのG4 DNA構造がメチル化されると、その構造が安定化するか検討する。G4構造の熱安定性はCircular Dichroism (CD)測定法により解析する。G4構造形成DNA中のCpG配列中のシトシンの5位をメチル化したオリゴヌクレオチドを化学合成し、PCR溶液(25 mM TAPS-NaOH (pH 9.3), 2 mM MgCl2, 0.1 mM DTT, and 0.1% Triton X-100)条件下でCDスペクトルを測定する。G4構造はそのトポロジー（パラレル、アンチパラレル、ハイブリッド）に依存して特異的なCDスペクトルを示す。その特長的なピーク値を25度から95度まで連続的に測定することによって、G4構造のTm値を算出し、その熱安定性がメチル化によって上昇するか検討する。さらに、種々のイオン存在下においてもその熱安定性を解析し、メチル化によってG4構造が安定化するメカニズムを解明する。メチル化により安定化するG4構造を同定した後に、それがメチル化されるとPCRが阻害されるかreal-time PCR法を用いて検討する。さらに細胞から直接PCRをかけるだけで標的遺伝子のメチル化レベルが測定できるか検討する。
次年度使用額が生じた理由	当初はサーマルサイクラーを購入する予定であったが、既設の機器で対応できることが判明したため次年度使用額が生じた。なお、30年度の直接経費としては物品費1,128,428円、旅費340,000円を予定している。