| 研究課題/領域番号 |
17K07109
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
菅生 紀之 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (20372625)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 分子・細胞・神経生物学 |
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| 研究実績の概要 |
これまでの我々の研究グループが先駆けて構築した神経細胞における核内分子の１分子イメージング解析手法によって、神経活動依存的な転写因子動態を明らかにしてきたが、動態と生理的意義に不明な点が多く残されている。本研究ではこれまでの手法を発展させ、マウス及びヒト神経細胞において転写因子と特異的遺伝子座の相互作用、そこから産生される転写産物の量を１分子蛍光イメージングで同時に定量計測する。さらに、神経細胞分化におけるDNA脱メチル化を介した転写制御の動態解析を進める。以上によって、核内分子動態から繋がる神経細胞分化・可塑性の原理・法則性を明らかにすることを目指す。
本年度は、（１）神経活動依存的遺伝子発現の動態を定量的に解析するため、最初期遺伝子Fosの遺伝子座にmRNAの可視化を可能にするMS2配列を3’非翻訳領域にCRISPR/Cas9法を利用したノックイン法でゲノムに挿入するためのベクターを構築した。（２）神経細胞分化過程でのDNA脱メチル化制御の動態を明らかにするために、DNA修復酵素DNAポリメラーゼβとタグタンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを初代培養細胞に遺伝子導入した後にタグに特異的に結合する蛍光色素で標識し、斜光レーザー顕微鏡による観察を行った。核内に多数の動的な輝点を観察することに成功し、変異原物質によるDNA損傷や神経活動に対する応答性を調べた。（３）CRISPR/Cas9法によるマウス初代培養神経細胞での遺伝子破壊に関する研究論文を発表した。さらに、マウス神経前駆細胞におけるDNA脱メチル化機構にDNAポリメラーゼβが必要であることを明らかにした研究成果を研究論文として発表すると共に国内外の学会で発表を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通り、実験はおおむね順調に進んでいる。その一方で、神経活動依存的遺伝子発現の動態解析を可能にするmRNA可視化細胞樹立のためのベクター構築は行ったものの、細胞株を得るには至っていない。また、予定していた神経活動依存なクロマチン構造変化が転写因子動態に及ぼす影響を調べる必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策として、mRNAを可視化できるマウス及びヒト細胞株の樹立を目指すと共に、これまでに解析を行ってきた転写因子CREBに加えて作製したDNA修復酵素DNAポリメラーゼβの動態解析をさらに進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
培養神経細胞に遺伝子導入を行い細胞株を樹立する実験を進める予定であったが、その実験が当初の予定よりもやや遅れていることから、それに予定していた費用を次年度で使用することとなった。
（使用計画）
実験を継続して行い、その経費・研究発表の旅費・研究成果の発表に充てる予定である。
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