2019 年度実施状況報告書

新規赤血球因子を介したマラリア原虫増殖抑制機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	17K07134
研究機関	名古屋大学
研究代表者	大野民生名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (90293620)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2021-03-31
キーワード	ゲノム編集 / 赤血球 / 原虫増殖抑制遺伝子 / ネズミマラリア原虫 / マウス
研究実績の概要	マウス９番染色体にはChar1/Pymrという強力なマラリア抵抗性遺伝子座が存在しているが、その原因遺伝子は同定されていない。代表者のこれまでの研究により、Rnf123遺伝子が有力な候補遺伝子と考えられたため、ゲノム編集技術でこの遺伝子の欠失（KO)マウスを作製し、マラリア感染感受性を解析したところ、わずかな原虫の増殖抑制と生存率の上昇が認められた。しかし、９番染色体に存在するマラリア抵抗性遺伝子座の絶大な効果と比較すると、Rnf123遺伝子欠失による効果はChar1/Pymr遺伝子座の効果と比較して極めて小さく、他にマラリア抵抗性を規定する遺伝子が存在する可能性が高いと考えられた。そこで次の有力な候補遺伝子を探索した結果、遺伝子産物が赤血球内に存在しているがその機能が明らかでないApeh遺伝子に着目するに至った。なお、本遺伝子はRnf123遺伝子に隣接している。特に、Apeh遺伝子のエクソン3に存在するアミノ酸置換（p.89P>R）は、マウスのマラリア抵抗性系統と感受性系統で明確に分離していた。そこで、ゲノム編集技術によりマラリア感受性であるNC系統のApeh遺伝子をKOしたマウスと、アミノ酸置換部位を抵抗性系統型に置換したKIマウスの作製を行った。KI系統は導入した変異のホモ化がKO系統より先に完了したため、マラリア原虫感染感受性の解析を予備的に開始した。まだ十分な個体数を用いた解析に至っていないが、KIマウスでは顕著なマラリア原虫の増殖抑制と生存率の劇的な改善が認められ、Apeh遺伝子のアミノ酸置換がChar1/Pymr遺伝子座のマラリア抵抗性遺伝子の本体である可能性が推定された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由マラリア抵抗性の原因遺伝子として極めて有力と考えられたRnf123遺伝子について、ゲノム編集技術でKOマウスを作製しマラリア感受性を解析したところ、Rnf123以外の遺伝子が関与しているという当初の想定とは異なる結果となった。そのため、Rnf123遺伝子以外の候補遺伝子を探索し直した結果、Apeh遺伝子の変異を見出した。そこで、新たにこの遺伝子についてKO系統とKI系統を作製しマラリア感受性の解析等が必要となったため、全体的に研究の進展が少し遅れている。
今後の研究の推進方策	(1)前年度に作製したApeh遺伝子のKOマウスとKIマウスについて、血球計数装置で赤血球数、ヘマトクリット値、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球粒度分布幅等を測定し、Apeh遺伝子変異の赤血球への影響を検討する。更に、3種のネズミマラリア原虫(P. yoelii 17XL, P. chabaudi AS, P. berghei ANKA)の感染実験を行い、感染後の血虫率(感染赤血球数/全赤血球数)と生存率を測定し、Apeh遺伝子やApeh遺伝子内のアミノ酸置換のマラリア抵抗性への関与を検証する。 (2)マラリア感染感受性系統（A/J, C3H, NC）と抵抗性系統（C57BL/6J, CBA, 129X1）間では、赤血球形成に関与すると考えられる複数の遺伝子の発現パターンが異なっていることを見出している。そこで、Apeh遺伝子のKOとKIマウスについてこれら遺伝子の発現を解析し、Apeh遺伝子のマラリア抵抗性に関わる遺伝子群の特定を行う。
次年度使用額が生じた理由	解析に着手した当初はマラリア原虫増殖抑制に関与しているのはRnf123遺伝子であると考えていたが、作製したKOマウスを用いた解析よりRnf123遺伝子が原因である可能性は低いとの結論に至った。そのため、他の候補遺伝子を探索した結果、Rnf123遺伝子に隣接するApeh遺伝子のエクソン3に存在するアミノ酸置換を伴う1塩基置換が原因である可能性が考えられた。そこで当該遺伝子のKOマウスとKIマウスを作製し解析する必要が生じたため実験期間の延長が必要となった。更に、使用しているマウス飼育室に蟯虫汚染が生じたため、一時的に感染実験を停止して駆虫処置を行う必要が生じたた事も実験期間の延長が必要となった要因の1つである。次年度使用となる経費については、Apeh遺伝子のKIマウスとKOマウスのマラリア感受性の解析を実施するための消耗品経費と、それらマウスの飼育に係る経費として令和2年度に使用する予定である。