| 研究課題/領域番号 |
17K07168
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
向井 秀幸 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (80252758)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | PKN3 / PKN2 / 血管内皮細胞 |
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| 研究実績の概要 |
PKN3ノックアウトマウスにおいては、メラノーマの血行性転移が抑制されている。その分子メカニズムを明かにするため、今年度、PKN3ノックアウトマウスから、大動脈や、肺・肝臓などの血管もしくは血管が豊富な組織を採取して、膜分画をとり、E-selectin, P-selectin, VCAM1, ICAM-1等の種々の細胞間接着因子の発現量を測定した。しかしいまだ野生型と比べて有意な発現量の差を認める分子を見いだすことはできていない。また、初代血管内皮細胞を、PKN3ノックアウトマウス肺から、磁気ビーズを用いて採取したが、特定の膜タンパク質の発現量について、野生型との有意な差は見いだせていない。HUVEC細胞をsiRNA処理することにより、PKN3ノックダウン血管内皮細胞シートをBoyden chamberのupper chamber内に作製し、その細胞シートを透過するがん細胞数を検討する実験にも着手しているが、いまだ安定した結果を得られていない。
新たな遺伝子改変マウス個体の作製実験については、下記の「現在までの進捗状況」欄に記載したとおり、当初の予定からの変更を行った。血管内皮細胞特異的ノックアウトマウスを作製するために、当初はTie2-Creマウスを利用する予定であったが、Tie2-Creマウスよりも、より血管内皮特異性が高いとされるCdh5-Creマウスが利用可能であることがわかり、今年度そのトランスジェニックマウスを、医薬基盤研究所から導入し、Cre-loxP システムによって、コンディショナルにPKN2をノックアウト可能なPKN2 flox/floxマウスと交配し、血管内皮特異的にPKN2をヘテロノックアウトしたマウスを得、現在、ヘテロ個体同士の交配により、ホモノックアウト個体を得ようとしている段階である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
(i) 本申請研究で使用を予定していた、IMPCによって樹立されたES細胞が、その後のquality check により、コンディショナルノックアウトの構築に失敗していることが示唆されたこと。 (ii) 血管内皮特異的PKN3ノックアウトマウスの作製にすでに着手している研究室がある旨の情報を入手したこと。 (iii) 我々が準備をすすめていた、PKN3のアイソフォームであるPKN2のコンディッショナルノックアウト可能なマウスがすでに樹立できたこと。
上記(i), (ii), (iii) の事情により、研究予定期間内に、オリジナリティのある研究成果を得るため、当初の実験計画を変更し、新たな遺伝子改変マウスの作製に関しては、血管内皮特異的PKN3ノックウアウトマウスではなく、血管内皮特異的PKN2ノックアウトマウスをめざすこととし、PKN3に関しては、既存のPKN3ノックアウトマウスを用いての実験に集中することとした。PKN2は、その構造類似性および発現様式から、PKN3との間で冗長性を有し、腫瘍転移へ関与することも予想されていたが、全身でのPKN2ノックアウトが胎生致死に至るため、この分野において解析が行われてこなかった分子である。今回のアプローチ変更により、PKN2の血管内皮細胞・腫瘍転移における機能を解析できるとともに、PKN3ノックアウトによる表現型をより明瞭にとらえることも期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
PKN3ノックアウト血管内皮細胞表面で、野生型マウスと比べて、発現量が有意に変化している細胞間接着分子は未だ見いだせていないので、この探索は今後も継続していく予定である。培養細胞レベルの実験については、上記の「研究実績の概要」欄に記載したように、マウスの初代血管内皮細胞を、十分量、コンタミなく準備することは比較的難しく、コストもかかることから、HUVECを用いたPKN3のノックダウン実験の方にウェイトをシフトしていく予定である。マウス個体を用いた実験については、PKN2の血管内皮特異的ノックアウトマウスが作製できた段階で、PKN3ノックアウトマウス、およびコントロールの野生型マウスと並べて、メラノーマの尾静脈-肺転移モデルを適用して、PKN2およびPKN3のメラノーマ転移への寄与の程度について検討していく。またPKN3ノックアウトマウスにおいて、PKN3 siRNA製剤が、付加的な転移抑制効果を持つかどうかについても、やはり尾静脈-肺転移モデルを用いて、検討していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末に購入を予定していた試薬が、年度内に搬入困難であることがわかったため、次年度への繰り越しとなったものである。
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