| 研究課題/領域番号 |
17K07185
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| 研究機関 | 関西学院大学 |
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研究代表者 |
荒木 啓吾 関西学院大学, 理工学部, 助教 (50756674)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 転写因子E2F3 / マイトファジー / ミトコンドリア / オートファジー / 癌 |
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| 研究実績の概要 |
これまでにE2Fファミリーの新規メンバーであるE2F3dを同定した。他のE2Fファミリーは核内に局在して転写因子として働くのだが、E2F3dはミトコンドリアの外膜に局在していることを明らかにした。E2F3dのミトコンドリア局在機構として「E2F3d のN末端に膜貫通領域があること」と「E2F3dのC末端がシャペロンタンパク質HSP70と結合してミトコンドリアに輸送されること」が分かった。
次に、不良ミトコンドリアを選択的に除去する機構（マイトファジー）にE2F3dが関与していることを明らかにした。不良ミトコンドリアは最終的にリソソームと融合して分解される。そこで、E2F3dを強制発現させた時にミトコンドリアタンパク質Tom20とリソソームタンパク質LAMP1を免疫蛍光染色法で観察したところ、E2F3dを発現させた時にTom20がLAMP1に取り込まれることが明らかになった。また、酸性下で蛍光を発する色素（Mtphagy Dye）をミトコンドリアに取り込ませた後、E2F3dを強制発現させると蛍光を発した。これはミトコンドリアがリソソームに取り込まれて酸性状況下に晒されたためと考えられる。以上より、E2F3dを強制発現させるとミトコンドリアがリソソームに取り込まれることが示された。
次に、CRISPR-Cas9を用いたゲノム編集によりE2F3dをノックアウト（KO）し、低酸素下で培養することでミトコンドリアにダメージを加えてマイトファジーを誘導した。野生型の細胞では低酸素培養によりマイトファジーが誘導されたが、E2F3d KO細胞ではマイトファジーが誘導されなかった。また、E2F3d KO細胞にE2F3dを戻してやるとマイトファジーが誘導されるようになった。以上より、内在性のE2F3dが低酸素培養により誘導されるマイトファジーに関与していることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①E2F3dの欠失変異体を用いてE2F3dのミトコンドリア局在機構について詳細に検討した結果、E2F3dのN末端領域とC末端領域がそれぞれ「ミトコンドリア外膜への停滞」と「ミトコンドリアへの輸送」という役割を担っていることを明らかにできた。
②マイトファジーはダメージを受けたミトコンドリアが最終的にリソソームに取り込まれて分解される機構である。アデノウィルスでE2F3dを強制発現させた時にミトコンドリアタンパク質とリソソームタンパク質が共局在していることが確認できた。また、リソソームに取り込まれたミトコンドリアの量を定量解析したところ、E2F3dの強制発現によりリソソームに取り込まれるミトコンドリアの量が増えることが確認できた。
③E2F3dは「がん」の悪性化に伴い発現が上昇する。生体内の悪性腫瘍において腫瘍の内側の細胞は低酸素下にあるため、低酸素によりダメージを受けたミトコンドリアを選択的に除去する分子機構が必要になる。がん細胞を低酸素下で培養するとマイトファジーが誘導されたが、E2F3dをノックアウトしたがん細胞では誘導されなかったことから、E2F3dががん細胞の低酸素誘導性マイトファジーに関与している可能性が考えられた。
以上より「E2F3dがマイトファジーを通して悪性がん細胞のミトコンドリアの品質管理に関与しているのではないか」という仮説をサポートする結果をこれまでに得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
E2F3dによるマイトファジーが「悪性がん細胞におけるミトコンドリアの品質管理」に関与している可能性から、「E2F3dの機能を阻害することで悪性がん細胞のミトコンドリアの品質を悪化させ、最終的に死滅させる方法の開発」を目的とする。
これまでにE2F3dをノックアウトしたがん細胞において低酸素誘導性マイトファジーが誘導されなくなることを確認した。そこで、ミトコンドリアの膜電位や活性酸素の蓄積量を測定することで、実際にE2F3d依存性マイトファジーが起きないことで不良ミトコンドリアが蓄積しているのかを検討する。そして、E2F3dをノックアウトしたことでミトコンドリアの品質が低下し、最終的に細胞死が誘導されるのかを解析する。
次に、低酸素によって惹起されるどのようなシグナルによってE2F3dによるマイトファジーが誘導されるのかを解析する。そして、そのシグナル伝達の阻害剤を用いることでE2F3dによるマイトファジーが阻害されるのかを検討する。阻害剤を用いてE2F3dの機能を阻害することで、最終的には不良ミトコンドリアが蓄積されて細胞死が誘導されるのかを検討する。
今後の展開としては、これまでに得られたE2F3dによるマイトファジー誘導機構の知見から、「がん細胞のミトコンドリアの品質を悪化させて、最終的に死滅させる新たな方法の開発」へと発展させることに焦点を当てて研究を推進する予定である。
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