| 研究課題/領域番号 |
17K07185
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
荒木 啓吾 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 非常勤講師 (50756674)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | マイトファジー / E2F3d / マイトファジー受容体 / シグナル伝達 / リン酸化 / 悪性がん細胞 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者は、悪性がん細胞で発現が高くなっている転写因子E2F3aのスプライシングバリアントである「E2F3d」を同定した。E2F3dはミトコンドリアの外膜に局在し、不良ミトコンドリアとオートファゴソームを連結することでマイトファジーを誘導する「マイトファジー受容体」として働き、悪性がん細胞においてミトコンドリアの品質管理に働いていることを明らかにした。
不良ミトコンドリア上のマイトファジー受容体とオートファゴソームの会合は、マイトファジー受容体のリン酸化によって制御されている。E2F3dの機能を制御している分子機構を解析するため、E2F3dをリン酸化するキナーゼの同定を試みた。リン酸化タンパク質検出試薬 Phos-tagゲルを用い、E2F3dのリン酸化によるバンドのシフトをウエスタンブロッティング法で検出した。他のマイトファジー受容体であるFUNDC1は、チロシンキナーゼSrcによってリン酸化される。そこで、SrcがE2F3dをリン酸化するかを調べるため、恒常活性化型SrcとE2F3dを共発現させたところ、E2F3dのバンドシフトは確認できなかった。
また、悪性がん細胞においてE2F3dの機能を阻害すると、不良ミトコンドリアが蓄積することで細胞死を誘導できる可能性がある。そこで、染色体DNA上のシトシンをチミンに置換する一塩基編集技術を用いて、E2F3dのコーディングシークエンス中にナンセンス変異を挿入し、E2F3dの発現を抑制することを試みた。E2F3dのコーディングシークエンス中にナンセンス変異を挿入することには成功したが、細胞の染色体DNAの全エキソン配列を解読したところ、E2F3dのコーディングシークエンス以外にも約100か所においてシトシンがチミンに置換されていた。これらの変異は、一塩基編集技術によるオフターゲット効果の影響だと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当該年度（当初の研究予定期間の最終年度）に所属機関を異動した。研究設備の違いから、妥当な結果を得ることができるような環境整備に時間がかかり、実験を計画通りに進めることができなかった。
これまで、E2F3dのリン酸化を評価する方法として、リン酸化によるバンドシフトをウエスタンブロッティング法で検出する方法を用いた。しかし、この方法は実験行程が煩雑であり、「E2F3dをリン酸化するキナーゼの同定」という目的を達成することが困難に思われた。そこで、マイトファジーに関与しているキナーゼを同定し、そのキナーゼによるマイトファジーがE2F3dの発現を抑制した細胞において誘導されなくなることを確認することで、E2F3d依存的にマイトファジーを誘導するキナーゼを同定することにした。
マイトファジーの誘導を評価する方法として、ルシフェラーゼタンパク質にミトコンドリア移行シグナルを付加し、ルシフェラーゼタンパク質をミトコンドリアに局在させた。その後、ルシフェラーゼアッセイでミトコンドリア局在型ルシフェラーゼタンパク質の量を定量することで、ミトコンドリアタンパク質の減衰（＝マイトファジー誘導の度合い）を評価する方法を確立した。E2F3dをリン酸化するキナーゼを同定する方法を変更し、マイトファジーの誘導を評価する実験系を確立するのに、計画以上に時間を要してしまった。
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| 今後の研究の推進方策 |
ミトコンドリア局在型ルシフェラーゼタンパク質を発現させた細胞に、種々の恒常活性化型およびドミナントネガティブ型のキナーゼを発現させ、ミトコンドリア局在型ルシフェラーゼタンパク質の減衰(マイトファジーの誘導)を解析する。その後、E2F3dの発現を抑制した細胞において、同定したキナーゼによるマイトファジー誘導が起きなくなるかを確認し、E2F3dへの依存性を明らかにする。
E2F3dの発現を抑制した細胞を一塩基編集技術によって作製しようとしたが、オフターゲット効果が確認されたため、ゲノム編集技術でE2F3dの発現を抑制した細胞は本実験に用いられない。shRNAによってE2F3dをノックダウンする方法は、他のE2F3メンバー（E2F3aなど）の発現も抑制してしまうが、他のE2F3メンバーはミトコンドリアに局在していないため、マイトファジーに関与している可能性は低い。そこで、shRNAによって全てのE2F3メンバーの発現を抑制した細胞において、同定したキナーゼによるマイトファジー誘導が起きなくなるかを確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2019年度に関西学院大学から東京医科歯科大学に移動し、実験機器類の変更など実験環境が変わったことで、実験の遂行に若干の遅延が起きた。また、実験方法の変更・開発を行ったために当初の計画よりも遅れが出てきたが、2020年度は確立した実験系を用いてE2F3dをリン酸化するキナーゼを同定する。
E2F3dの発現を抑制した細胞を作製するため、一塩基編集技術によって染色体DNA上のE2F3dのコーディングシークエンス中にナンセンス変異を挿入したが、オフターゲット効果が生じてしまった。ゲノム編集技術におけるオフターゲット効果の問題を現段階で解決することは困難なため、他のE2F3メンバーの発現も抑制してしまうことになるが、shRNAによってE2F3dを含めたE2F3メンバーの発現を抑制した細胞を実験に用いることにした。
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