| 研究課題/領域番号 |
17K07186
|
|---|
| 研究機関 | 公益財団法人がん研究会 |
|---|
研究代表者 |
水谷 アンナ 公益財団法人がん研究会, がん化学療法センター 分子生物治療研究部, 研究員 (30615159)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | マイクロRNA生合成 / タンキラーゼ / 翻訳後修飾 |
|---|
| 研究実績の概要 |
さまざまながんで広くマイクロRNA（miRNA）の発現減少が認められることが知られているが、原因は明らかではない。本研究では、miRNA生合成に関わる複数の分子にポリ（ADP‐リボシル）化酵素であるタンキラーゼに結合すると考えられるモチーフ配列があることに着目した。ポリ（ADP‐リボシル）化とは標的タンパク質にポリ（ADP‐リボース）鎖を付加する翻訳後修飾である。タンキラーゼによりポリ（ADP‐リボシル）化されたタンパク質は、物性が大きく変化するとともに、ポリ（ADP‐リボース）鎖がシグナルとなりユビキチン化による分解へと導かれることが知られている。miRNA生合成は、①pri-miRNAの転写、②pre-miRNAの産生、③pre-miRNAの核外輸送、④Dicerによるpre-miRNA切断、⑤RNA誘導型サイレンシング複合体の形成、の五段階から成る。前年度は、タンキラーゼが調節しているのはどのステップか明らかにするために、複数のmiRNAについてタンキラーゼ阻害剤処理下で、pri-miRNA、pre-miRNA、mature miRNAを定量的に検出し、②すなわち、pri-miRNAからpre-miRNAへの切り出しの段階でタンキラーゼが調節していることが示唆されるデータを得た。本年度は、タンキラーゼによるmiRNA生合成調節のメカニズムの詳細を明らかにするために、pre-miRNAの産生に関わる複数の分子をクローニングし、それらの分子に存在するタンキラーゼ結合モチーフと考えられる配列のアミノ酸を置換した変異体を作製した。また、pre-miRNAの産生を定量的に解析できるようルシフェラーゼアッセイで評価できる実験系を構築した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度の検討により、pri-miRNA、pre-miRNA、mature miRNAについて、定量的RT-PCRにて定量的に検出することを試みたが、内部標準を探すのに手間取ってしまったものの、適当な内部標準を見出すことができ、pri-miRNA、pre-miRNA、mature RNAの定量ができるようになった。複数のpri-miRNA、pre-miRNA、mature miRNAについて、定量的RT-PCRで検出を行うことで、タンキラーゼ阻害剤を用いた検討、また、タンキラーゼの酵素活性のないPARP-DEADを用いた検討から、タンキラーゼの酵素活性がpri-miRNAからpre-miRNAを切り出すプロセスを調節している可能性が示唆されるデータが得られた。それらの結果を踏まえ、本年度はpri-miRNAからpre-miRNAを切り出すプロセスに関わっている主な分子のクローニングを試みた。DGCR8については速やかにクローニングできたものの、ヒト細胞のcDNAからのDROSHAのクローニングがうまく進まず、変異が入ってしまう状況が続いたが、テンプレートをマウスのcDNAに変えたことで全長のmDroshaのクローニングに成功した。得られたhDGCR8とmDroshaについては、それらの分子に存在するタンキラーゼ結合モチーフと考えられる配列のアミノ酸を置換した変異体を作製した。また本年度は、pri-miRNAからpre-miRNAのプロセッシングを定量的に解析できるようルシフェラーゼアッセイで評価できる実験系を構築することができた。これにより、次年度の検討がスムーズに進むと考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
前年度は、miRNAのプロセッシングの複数あるステップのうち、pri-miRNAからpre-miRNAへと切り出されるステップにおいてタンキラーゼが調節している可能性が示唆されるデータを得た。本年度は、pri-miRNAからpre-miRNAの切り出しに関わる分子であるDGCR8とDroshaのクローニングを行い、それらの分子に存在するタンキラーゼと結合すると考えられるモチーフ配列のアミノ酸を置換した変異体を作製した。本年度に構築したpri-miRNAからpre-miRNAのプロセッシングを定量的に解析できるようルシフェラーゼアッセイで評価できる実験系を用いて、タンキラーゼによるプロセッシングの調節について定量的に評価を行う。またDGCR8やDroshaの野生型および変異型を過剰発現にした実験系により、タンキラーゼとそれらの分子の結合について検討を行う予定である。DGCR8やDroshaの野生型および変異型を用いて、pri-miRNAからpre-miRNAのプロセッシングについても評価を行う予定である。これらの検討により、タンキラーゼがどのようにpri-miRNAからpre-miRNAのプロセッシングを調節しているのかについての詳細なメカニズムを明らかにする予定である。
本年度は本研究の最終年度であるため、本検討で得られた結果をまとめ、国際学術誌に投稿する予定である。必要な論文改訂作業を行い、論文の掲載を目指すことにしている。また学会でも積極的に得られた知見を発表する予定である。
|
