担がん患者における血漿遊離DNAの特性についての基礎的検討

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K07197
• 研究機関: 佐賀大学
• 研究代表者: 荒金 尚子 佐賀大学, 医学部, 准教授 (20321846)
• 研究分担者: 佐藤 明美 佐賀大学, 医学部, 助教 (20568357) ; 中村 朝美 佐賀大学, 医学部, 助教 (90457490)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: circulating tumor DNA / EGFR / extracellular vesicle

研究実績の概要

１．担がん患者ctDNAで認めた二峰性ピークの臨床的意義: 前年度までで、肺がん患者ctDNAは、long fragment（5 Kb）、short fragment（170 bp）の二峰性ピークが見られた事、遠隔転移を有する症例で優位にlung fragmentの量が多かった事を示した。Long fragmentの存在機序について、DNase1、DNase1L3の量とlong fragment の相関について検討したが、相関は見られなかった。そのため、long fragmentの保護機構が働いていると考え以下の検討を行っている。
２．2峰性ピークの各DNAの塩基配列、会合分子の同定: long fragment、short fragmentのDNAを各々抽出し、次世代シークエンス解析の外注解析を行った。進行肺がん患者と共にコントロールとして健常人血漿遊離DNAも同時に検査に供した。その結果、分子Aが候補として同定された。現在、分子Aの合成、単離、ctDNAとの結合能について検討中である。
３．Long fragmentの存在部位、extracellular vesicle(EV) との関連について: 上記の検討と共に、EVに内包ないしは結合によりlong fragmentが保護されている可能性について検討した。遠心条件を変え、種々のサイズのEVを抽出し、DNAサイズ、ctDNA含有量について検討中である。まず、肺癌細胞株培養上清よりEVを単離し、そのサイズ、表面マーカーの解析を行い、現在ヒト血漿DNAの解析に着手している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまで、肺がん患者の血漿検体を保管していたため、臨床的検討を迅速に行う事ができた。ctDNAサイズ解析、各ピークからのDNA抽出もそれまで解析準備を行っていたことから、計画通り進行する事ができた。

今後の研究の推進方策

1.Long fragmentの存在機序について ①会合分子の同定: long fragment、short fragmentのDNAを各々抽出し、次世代シークエンス解析の外注解析を行った。進行肺がん患者と共にコントロールとして健常人血漿遊離DNAも同時に検査に供した。その結果、分子Aが候補として同定された。分子Aの合成、単離は終了している。次にDNAとの結合性について、まず合成DNAと、次にヒトから抽出したctDNAとの結合能について検討する。②extracellular vesicle(EV) との関連について: 上記の検討と共に、EVに内包ないしは結合によりlong fragmentが保護されている可能性について検討を継続する。まず、肺癌細胞株培養上清よりEVを単離し、そのサイズ、表面マーカーの解析を行い、現在ヒト血漿DNAの解析に着手する。
2.2峰性ピークの各DNAおよび会合分子ががん進展に関与するか
１の結果に基づき、がんの浸潤、転移におけるctDNA、さらにlong fragment、short fragmentの効果について検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Mechanisms of acquired resistance to afatinib clarified with liquid biopsy. (2018)
  • 著者名/発表者名: 1.Nakamura T, Nakashima C, Komiya K, Kitera K, Hirai M, Kimura S, Aragane N.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 13 ページ: e0209384
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0209384.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Phase II trial of gefitinib plus pemetrexed after relapse using first-line gefitinib in patients with non-small cell lung cancer harboring EGFR gene mutations (2018)
  • 著者名/発表者名: 2.Uchibori K, Satouchi M, Sueoka-Aragane N, Urata Y, Sato A, Imamura F, Inoue T, Tachihara M, Kobayashi K, Katakami N, Kokan C, Hirashima T, Iwanaga K, Mori M, Aoe K, Morita S, Negoro S
  • 雑誌名: Lung Cancer 巻: 124 ページ: 65-70
  • DOI: doi: 10.1016/j.lungcan.2018.07.031.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Investigation of appropriate pre-analytical procedure for circulating free DNA from liquid biopsy (2018)
  • 著者名/発表者名: 3.Sato A, Nakashima C, Abe T, Kato J, Hirai M, Nakamura T, Komiya K, Kimura S, Sueoka E, Sueoka-Aragane N
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 9 ページ: 31904-31914
  • DOI: doi: 10.18632/oncotarget.25881.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Automated DNA extraction using cellulose magnetic beads can improve EGFR point mutation detection with liquid biopsy by efficiently recovering short and long DNA fragments (2018)
  • 著者名/発表者名: 4.Nakashima C, Sato A, Abe T, Kato J, Hirai M, Nakamura T, Komiya K, Sueoka E, Kimura S, Sueoka-Aragane N
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 9 ページ: 25181-25192
  • DOI: doi: 10.18632/oncotarget.25388.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Current Status and Problems of T790M Detection, a Molecular Biomarker of Acquired Resistance to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors, with Liquid Biopsy and Re-biopsy (2018)
  • 著者名/発表者名: 5.Komiya K, Nakashima C, Nakamura T, Hirakawa H, Abe T, Ogusu S, Takahashi K, Takeda Y, Egashira Y, Kimura S, Sueoka-Aragane N
  • 雑誌名: Anticancer Res 巻: 38 ページ: 3559-3566
  • DOI: doi: 10.21873/anticanres.12628.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [図書] 呼吸器疾患 診断治療アプローチ (2018)
  • 著者名/発表者名: 荒金尚子
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: 中山書店
  • ISBN: 978-4-521-74525-1