| 研究課題/領域番号 |
17K07225
|
|---|
| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
|---|
研究代表者 |
堀内 大 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (30608906)
|
|---|
| 研究分担者 |
村上 孝 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (00326852)
高木 徹 埼玉医科大学, 医学部, 助手 (20536891)
松井 政則 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (50199741)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 腫瘍微小環境形成 |
|---|
| 研究実績の概要 |
糖タンパクGPNMB/DC-HILは、免疫系や中枢神経系に発現し、免疫調節作用や神経細胞保護作用など多彩な機能を持つことが報告されている。近年、創傷治癒過程においてマクロファージの発現するGPNMBが間葉系幹細胞の増殖を促進することも明らかとなった。また、GPNMB/DC-HILは、骨肉腫などの間葉系悪性腫瘍に留まらずトリプルネガティブ乳癌など一部の上皮系悪性腫瘍の細胞膜上にも発現しており、腫瘍細胞の浸潤や転移など腫瘍病態進展との関連が報告されている。このことはGPNMB/DC-HILが腫瘍細胞と宿主由来細胞の双方の機能を調節し、腫瘍進展に関わる微小環境形成に影響を及ぼしていることが考えられる。
本研究はGPNMB/DC-HILと腫瘍内微小環境形成との関係を明らかにすることを目的としている。本年度では、ゲノム編集技術の一つであるCRISPR/Cas9システムを用いてGPNMB/DC-HIL関連遺伝子をノックアウトしたマウス腫瘍細胞を樹立した。WebツールCRISPRdirectにより複数のガイドRNA配列を設計し、それに基づき人工合成したオリゴDNAをCRISPR/Cas9発現ベクターに組み込み、腫瘍細胞株に遺伝子導入した。標的遺伝子の切断はT7E1アッセイにより確認した。標的分子が発現していない細胞はセルソーターで分取し、その後、限界希釈法によりGPNMB/DC-HIL関連遺伝子ノックアウト細胞クローンを樹立した。樹立したノックアウト細胞は、遺伝子ノックアウトを行なっていないコントロール細胞と同様の細胞形態及びフェノタイプを示し、in vitroでの細胞増殖能に顕著な変化は認められなかった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度はGPNMB/DC-HIL関連遺伝子をノックアウトするためのCRISPR/Cas9システムを確立し、ノックアウト細胞株を樹立した。しかし、Off-targetによる細胞表現系の変化や増殖能の検討など、ノックアウト細胞株作製に予定以上の時間を費やし、生体内でのGPNMB/DC-HILシグナルのノックアウトに使用する組換えアデノ随伴ウイルスの作製には着手できなかった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度作製したノックアウト細胞を用いて、腫瘍細胞及び宿主由来各種細胞の挙動についてin vitro/in vivo検討を進める。また、GPNMB/DC-HILを発現しない宿主細胞のソースとして、ノックアウト細胞作成に使用したガイドRNA配列を利用したGPNMB/DC-HIL ノックアウトマウスの作製を進めたい。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
2017年度はAAVベクター作製に着手できず、そのため次年度使用額が生じた。
次年度使用額は2018年度以降、AAVベクター作製などに使用する計画である。
|
