| 研究課題/領域番号 |
17K07232
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
多田 誠一 国立研究開発法人理化学研究所, 創発物性科学研究センター, 研究員 (30598165)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | 細胞膜透過ペプチド / cDNAディスプレイ / in vitro セレクション / siRNA / 細胞内導入 / 進化分子工学 / 遺伝子発現抑制 / shRNA |
|---|
| 研究実績の概要 |
昨年度までに細胞膜透過ペプチド（CPP）の選別に用いるcDNAディスプレイ複合体の作成時における諸課題について検討を終えたため、当初の予定では培養細胞株の準備が整い次第CPP選別を開始する予定であった。しかし、cDNAディスプレイ複合体の作成過程においてmRNA転写時に用いる鋳型DNAが残存してしまうことが確認された。このDNA残存はCPP選別の過程での目的配列濃縮に影響を及ぼす可能性があるため、残留DNAの除去法の検討を余儀なくされた。現在は残留DNAの選択的分解法と、cDNAディスプレイの分離精製の2手法の有効性を比較中である。また、この検討による計画の遅れに対応するため、当初は蛍光タンパク質を恒常的に発現する培養細胞株を構築する予定を変更し、遺伝子導入による蛍光タンパク質の一過性発現系での実験系に切り替えた。蛍光タンパク質の恒常発現系ではshRNAの細胞内導入前の時点で細胞内にあらかじめ発現済みの蛍光タンパク質が蓄積してしまい、発現抑制を開始しても蛍光の低下量が限定される可能性が懸念される。その点で、mRNAの細胞導入によって蛍光タンパク質発現を一定のタイミングで発現させることにより、導入shRNAによる発現抑制効果の評価がより明確になるものと期待される。蛍光タンパク質の一過性発現の誘導に用いるmRNAの設計はcDNAディスプレイの課題解決中に既に検討済みであるため、残存DNAへの対応が完了し次第CPPの選別に着手できる体制を整えている。本年度は想定外の問題やその対応などのため、研究の顕著な進展は見られなかったが、計画変更により翌年度での挽回が期待できるものと考える。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は当初計画ではcDNAディスプレイ複合体形成法の構築を完了して蛍光タンパク質発現細胞株の構築を終えている予定であった。しかし、cDNAディスプレイ複合体による選別条件の確認中にmRNA作成用の鋳型DNAの残存が明らかになった。鋳型DNAはCPPの選別後の時点まで残存してしまうと二回目以降のCPP選別の直前に実施されるPCRによって増幅がかかるため、有効なCPP配列の特定に影響を及ぼす可能性がある。このため残存DNAを除去する手法の検討を余儀なくされたため計画に遅れが生じた。CPP配列の選別に使用する予定の蛍光タンパク質発現細胞株の構築も同時期に進めていたが、cDNAディスプレイ複合体作成における進捗の遅れに対応するため細胞株準備についても計画を変更して、計画遂行への影響を最小限に留められるよう対応した。想定外の問題により進捗状況に遅れが生じたものの対応が進められているため、計画全体への影響は限定的なものと考えている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今回の進捗遅れの主因となっているcDNAディスプレイ複合体中の残存DNAについて、すでに各種DNAse処理などよる除去を検討済みだが現時点で効果は限定的なものに留まっている。そのため現在はcDNAディスプレイ複合体の分離精製法の改善や、制限酵素処理等の手法により残存DNAのPCRによる増幅が抑制される条件の検討を実施してCPP選別の影響を排除し、できるだけ速やかにcDNAディスプレイ複合体によるCPP選別に移る予定である。CPP選別に使用する蛍光タンパク質発現細胞株は、当初の予定を変更し、mRNAの細胞内導入による蛍光発現の一過性発現系をもって代替することとして、進捗遅れの挽回とタンパク質発現抑制の明確化を図る。蛍光タンパク質の恒常発現細胞株においては、CPPによるshRNAの細胞導入を実施する前にあらかじめ発現済みの蛍光タンパク質が細胞内に蓄積されていると考えられるため、shRNAによる発現抑制後も蓄積された蛍光タンパク質による蛍光がバックグラウンドとして検出されることでshRNAの効果が確認されにくくなることが予想された。このため、蛍光タンパク質を一過的に発現させることにより事前の蛍光タンパク質の蓄積による影響を解消できるものと期待される。cDNAディスプレイ複合体に関する課題を検討中に、一過的発現系を構築するためのmRNA設計などを既に実施しており、残存DNAの問題を解決し次第早急にCPPの選別に着手する予定である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
計画の進捗に一部遅れが生じたため予算の未執行分が発生した。研究計画を変更して進捗を挽回することで、CPPの選別にかかる物品の購入等で次年度使用額を適切に執行していく予定である。
|
