| 研究課題/領域番号 |
17K07245
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| 研究機関 | 金城学院大学 |
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研究代表者 |
田平 知子 金城学院大学, 薬学部, 准教授 (50155230)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 転写因子 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
MIBP1（HIVEP2）遺伝子はDNA結合ドメインとしてZincフィンガーを持つ巨大転写因子をコードしている。本研究は、ゲノム編集により転写因子MIBP1（HIVEP2）にエピトープタグ配列を挿入し、タグ配列に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降-シーケンスを行う方法（CETCh-seq法）を確立し、MIBP1の転写因子としての機能、特に脳神経系での標的遺伝子を解明することを目指している。本年度は、ゲノム編集を行うために作製した2種類のプラスミド（CRISPRガイドRNAおよびCas9を発現するプラスミド、エピトープタグ挿入用ドナープラスミド）を導入した培養細胞（HT1080線維肉腫細胞およびHCT116大腸がん由来細胞）の解析を行った。薬剤耐性により選択したクローンをPCRおよびシーケンス解析することにより、MIBP1遺伝子の末端に相同組換えによりFLAG配列がノックインされたクローンを選別した。HT1080由来のクローン（HT1080-M5）、HCT116由来のクローン（HCT116-M15）においてそれぞれ片側のアレルにのみノックインが検出された。それらの細胞をウエスタンブロット解析することにより、全長約270 kDのMIBP1-FLAG融合タンパク質の発現を確認した。また、抗FLAG抗体を用いて融合タンパク質を免疫沈降できることを確認した。以上のようにクロマチン免疫沈降（ChIP）を行うための条件検討を進めている。また一方で、公共データベース等に登録されている高速シーケンサーを利用した遺伝子発現解析の結果をもとに、MIBP1の機能についての情報学的解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度行ったHT1080細胞を用いた実験でゲノム編集によるノックインの効率が予想より低かったため、本年度新たにHCT116細胞のゲノム編集を行った。しかし、薬剤耐性のクローンは多数得られたが、相同組換えにより目的通りのノックインを起こしているクローンの割合は低かった。CETCh-seq法の原著では、薬剤耐性に基づいて選択したプールの細胞を使用することを推奨しているが、今回の実験で得られたプールでは目的のノックイン細胞以外の割合が多くなる可能性があるため、方針を変更してプールではなく個々の細胞を解析することにした。また、HT1080-M5とHCT116-M15について、ウエスタンブロット解析によりMIBP1-FLAG融合タンパク質が安定に検出される条件を見出すのに時間がかかった。これはMIBP1タンパク質が分解されやすい性質を持つためではないかと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
転写因子MIBP1の末端に相同組換えによりFLAGエピトープタグがノックインされた細胞をを用いてMIBP1タンパク質結合部位の探索を行う。具体的には、FLago抗体を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）を行い、次に超並列型シーケンサーを用いてChIPにより回収されたDNAの配列解析（ChIP-seq解析）を行う。これによりMIBP1が結合する遺伝子群を同定する。また、並行して、神経系の細胞分化とMIBP1の発現誘導の関係を検討し、脳神経系での標的遺伝子を解明するために適切な細胞系にCETCh-seq法を応用する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
クロマチン沈降実験およびそれにより得られたDNAのシークエンスを本年度に行う予定であったが、実験計画がやや遅れているため、それらの実験を遂行できなかった。次年度にこれらの実験を行う予定である。
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