| 研究課題/領域番号 |
17K07245
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| 研究機関 | 金城学院大学 |
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研究代表者 |
田平 知子 金城学院大学, 薬学部, 准教授 (50155230)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 転写因子 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
MIBP1（HIVEP2）遺伝子はZincフィンガーを持つ全長約270 kDの転写因子をコードしている。MIBP1タンパク質が結合する配列として、HLA－B遺伝子のプロモーター上流のNF-κB応答配列に類似した配列や、ソマトスタチン受容体2 (SSTR2)遺伝子のプロモーター上流のTCに富む配列が報告されているが、ゲノムワイドにどのような遺伝子の発現制御を行っているのか不明な点も多い。そこでCETCH-Seq法を参考にゲノム編集によりMIBP1タンパク質のC末端にFLAGタグを挿入し、タグ配列に対する抗体を用いてMIBP1の転写因子としての機能を解析している。
本年度はゲノム編集により片側のアレルからMIBP1-FLAG融合タンパク質を発現するように改変したHCT116-M15細胞の解析を行った。 この細胞を用いてCUT&RUN法による解析を行い、上記のMIBP1タンパク質が結合する既知DNA領域（以下、それぞれuHLAB, uSSTR2と略称）が抗FLAG抗体により濃縮されるかどうかをリアルタイムPCRにより検討した。このときゲノム編集していないHCT116細胞を対照とした。また、コントロール実験に抗トリメチルヒストンH3抗体を用いた。その結果、uHLABは抗トリメチルヒストンH3抗体により濃縮され、HCT116細胞でこの領域の転写活性が高いことを示す結果となった。しかし、抗FLAG抗体ではuHLABの濃縮は認められず、核内でFLAG-MIBP1タンパク質が結合する配列を検出するという当初の目的が達成できているかどうか確認できなかった。MIBP1タンパク質のDNAへの結合を検出するためには細胞の固定によりクロスリンクすることが必要である可能性もあるので、CETCH-Seq法のプロトコールに従いクロマチン免疫沈降（ChIP）を行い、実験条件の検討を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
MIBP1タンパク質は分子量が大きく、DNA結合部位であるZincフィンガーとFLAGを付加したC末端が離れているためにCUT＆RUN法では結合DNA配列を切り出すことが難しい可能性がある。また、細胞の固定によりタンパク質とDNAをクロスリンクすることが必要である可能性もある。このため通常のクロマチン免疫沈降法にきりかえて条件検討を行ってきたが、新型コロナウイルス感染症による影響で研究活動が当初の計画通りに進まなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
ゲノム編集により転写因子MIBP1の末端にFLAGエピトープタグがノックインされた細胞を用いてMIBP1タンパク質が結合するDNA配列の探索を行う実験を継続する。CUT&RUN法についてはこれまでは生細胞を対象としていたが、ホルマリン固定した細胞を用いる方法も検討する。並行して、通常のクロマチン免疫沈降法（ChIP）を行う場合の、固定条件およびDNAの断片化の条件も検討する。これらの方法で回収されたDNAについてリアルタイムPCRで候補領域の濃縮を確認したのちに、超並列型シーケンサーを用いて塩基配列解析を行う。これによりMIBP1タンパク質が結合する遺伝子群を同定し、同タンパク質が関与すると考えられる神経分化などにおける動態を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症に対する対応に時間がとられ、実験条件を検討するのに十分な時間をとることができなかった。また試薬などの調達にも支障を生じた、本年度はこれまでの結果をふまえて条件検討を行い、一部は外部委託を利用して実験を遂行する予定である。
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