| 研究課題/領域番号 |
17K07278
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
島 弘季 東北大学, 医学系研究科, 助手 (00448268)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | RNA / N6-メチルアデノシン / 転写後調節 / RNA安定性 / S-アデノシルメチオニン / RNA結合タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
今年度は、S-アデノシルメチオニン（SAM)合成酵素MAT2AのmRNAの安定性を制御するフィードバック機構について研究を行い、成果の一部を論文として発表した（1）。また、3'非翻訳領域(UTR)に結合し、mRNA安定性制御に関わるタンパク質の探索を行った（2）。今年度の補助金は、主に上記の研究の遂行のための実験用試薬などの購入に充てられた。
1.この論文は、Cell Reports誌21巻に掲載された。この論文では、細胞内のSAM量に応じてMAT2A mRNA の安定性が変動し、その制御には3'UTRの特定の部位のN6-メチルアデノシン修飾（m6A)が重要であること、そのm6Aを導入するのはMETTL16であることを明らかにした。
2.MAT2AのmRNAの安定性制御の分子メカニズム解明のために、3'UTRに結合するタンパク質の探索を行った。ルシフェラーゼ遺伝子下流にMS2ヘアピン配列とマウスMAT2A 3'UTR配列を接続したレポーターベクターを、Bio-tag付きMS2 coat protein発現ベクターとともに導入したHeLa細胞から、ストレプトアビジンビーズを用いてレポーターmRNPを分離後、SDS-PAGEを経て質量分析によってタンパク質を同定した。ネガティブコントロールとしてMS2ヘアピン配列を含まないレポーターベクターを用いて同じ実験を行い、バックグランドを除いた差分を結合タンパク質と評価した。さらに、3'UTRのm6A標的部位をチミンで置換したレポーターベクターを用いて実験を行い、野生型3'UTRの結果と比較することで、m6Aに依存してMAT2A 3'UTRに結合するタンパク質を同定することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上述の通り、MAT2A 3'UTRに結合するタンパク質を分離、同定する系を構築した。さらに、変異型レポーターを用いることで、m6Aに依存して3'UTRに結合するタンパク質を絞り込むことができた。そのようなタンパク質群には、前述のMETTL16が含まれていたことから、この系により当初の目的を概ね達成できたと評価する。
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| 今後の研究の推進方策 |
概ね研究計画の通りに実施する。すなわち、MAT2A 3'UTRに結合するタンパク質のうち、細胞内SAM量に応じて結合が変動するものを探索する。その際には、定量的質量分析あるいは必要に応じてウエスタンブロットを行う。細胞内SAM量の変動には、培地にSAMおよびMAT阻害剤シクロロイシンを添加することによって行う。
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