| 研究課題/領域番号 |
17K07290
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| 研究機関 | 学習院大学 |
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研究代表者 |
菱田 卓 学習院大学, 理学部, 教授 (60335388)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 紫外線 / ヌクレオチド除去修復 / DNA相同組換え / 倍数体 / 出芽酵母 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度、申請者は、2倍体細胞が1倍体細胞に比べて高い紫外線耐性能を持つことや、DNA相同組換え機構が2倍体の紫外線耐性に必須の機能を果たしていることを明らかにした。そこで今年度は、CLUV環境における相同組換え修復機能の役割に注目して解析を行った。まず初めに、組換えの基質となる1本鎖DNAと紫外線による直接的な損傷であるピリミジンダイマーの蓄積量について、1倍体と2倍体NER欠損細胞を用いて解析した。各損傷の検出にはRPA-YFPフォーカス形成とピリミジンダイマー抗体によるゲノムDNAドットブロットアッセイを用いた。その結果、ピリミジンダイマーは１倍体と2倍体のいずれにおいてもCLUVに依存して同程度の蓄積が見られた一方で、RPA-YFPフォーカス形成は2倍体において有意に低下していることがわかった。また、このような１倍体と２倍体のフォーカス形成の違いは、定常期の細胞では見られず、対数増殖期のような細胞が増殖する環境に依存して起こっていた。以上の結果より、CLUV耐性の細胞増殖能は、ピリミジンダイマーではなく1本鎖DNAの蓄積量と相関性が見られることが示された。次に、二倍体rad14欠損細胞を用いてCLUV環境におけるヘテロアリル間の組換え頻度の測定を行ったところ、CLUVに依存して顕著な増加が見られた。以上の結果より、CLUV環境では、ピリミジンダイマーの蓄積が細胞増殖阻害の直接的な原因ではなく、むしろ、ピリミジンダイマーによる複製阻害が一本鎖DNAの蓄積を引き起こし、この処理能力の有無が細胞増殖の能力（CLUV耐性能）に大きく影響していると考えられる。さらに、２倍体細胞では通常あまり起こらない相同染色体間の組換えが複製阻害の解消に重要な役割を果たしていることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題の主要なテーマである「倍数性の増加がCLUVストレスに対する耐性獲得(適応)に果たす役割の解明」に関しては、一本鎖DNAの蓄積の有無が耐性能と相関性があることや、相同染色体間の組換えが２倍体において顕著に増加することを明らかにするなど、大きな進展が見られた。一方、「損傷染色体を持つ細胞の非対称分離の分子メカニズムの解明」に関しては、タイムラプス解析ではある程度非対称分離の傾向を見ることができたが定性的であることや、実験の性質上、メカニズムの解析には向いていないため、現在定量化が可能な実験系の確立に向けて研究を行なっている。以上の進捗状況を踏まえて、現時点では概ね順調に進展している と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
「倍数性の増加がCLUVストレスに対する耐性獲得(適応)に果たす役割の解明」：一本鎖DNAに結合するRPA-YFPのフォーカス形成の観察から、CLUV環境では、一倍体の約７割の細胞がフォーカスを形成しているにも関わらず、チェックポイントの活性化が起こらないことを見出している。急性の損傷の場合、７割以下でもチェックポイントの活性化が起こるため、慢性的なDNA損傷と急性DNA損傷の条件の違いによってチェックポイント活性化の閾値が変化する可能性が示された。そこで、チェックポイントタンパク質の検出株やYFP融合タンパク質による蛍光顕微鏡観察によってチェックポイントタンパク質の挙動を詳細に解析する。
「損傷染色体を持つ細胞の非対称分離の分子メカニズムの解明」：酵母細胞をアルファファクター等により同調することで、RPA-YFPフォーカスを持つ細胞の１細胞周期後の母、娘細胞への分配を定量化する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
YFP融合株や相同染色体間の組換え測定に使用する細胞株の作製に予想以上の時間がかかったため。また、DNA損傷チェックポイント経路の役割に関する新たな知見が得られたため、この解析のための酵母株作製や分子生物関連試薬、抗体等の物品日に使用する。
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