| 研究課題/領域番号 |
17K07291
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| 研究機関 | 法政大学 |
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研究代表者 |
石黒 亮 法政大学, マイクロ・ナノテクノロジー研究センター, 研究員 (70373264)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 筋萎縮性側索硬化症 / 前頭側頭葉変性症 / グアニン四重鎖 / TDP-43 / RNA / RNA立体構造 / 神経変性疾患 / mRNA輸送 |
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| 研究実績の概要 |
TDP-43は、RNA認識モチーフを持つタンパク質でALS（筋萎縮性側索硬化症）やFTLD (前頭側頭葉変性症)患者の神経細胞内に出現する封入体の主要成分である。また、家族性及び孤発性ALSあるいはFTLDでは多数のTDP-43遺伝子(TARDBP)突然変異が報告されている。しかし本来の機能が不明であるため、何故TDP-43の異常がALSなどの神経変性疾患を引き起こすのか全く解っていなかった。研究代表者はTDP-43が、グアニン四重鎖構造(G-quadruplex)と呼ばれる特殊なRNA立体構造を認識し、核から遠く離れた神経末端に輸送することを発見した。これまでに１０種類のヒトALS由来点突然変異のタンパク質を発現・精製し、グアニン四重鎖との相互作用を確認したところ、有意に結合が低下していることを定量的に確認した。当該年度は細胞内での突然変異によるmRNA輸送への影響および、その輸送を司るタンパク質因子の捜索を中心に解析を続行した。突然変異のタンパク質のグアニン四重鎖(G4)mRNA認識に及ぼす影響に関しては、培養細胞を用いた定量実験系を立ち上げる事が出来た。また、輸送に関わるタンパク質因子に関しては、質量分析により微小管関連タンパク質を同定する事に成功した。新たな実験系を用いる事で、正確に定量する事が出来る様になり、相互作用タンパク質因子の発見は発症機序解明のみならず、治療薬創出にも役立つと期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
これまでの研究の結果、TDP-43が標的mRNAを核から遠く離れた局所的翻訳システムへ輸送する分子メカニズムの詳細が明らかとなって来た。また、ヒトALS由来点突然変異を有するTDP-43はその機能が低下していることも突き止めた。当該年度は定量的な実験系を構築できた事が大きな前進と言える。まず培養細胞にMS2-GFP融合蛍光タンパク質を発現させ、同時にMS2結合配列を有するG4mRNAを発現させる事で、G4mRNAの局在を観察する実験系を樹立。G4mRNAの細胞内局在をGFPの蛍光シグナル強度として定量的に計測する事に成功した。さらにその細胞でTDP-43を強制発現させると核に多く留まっていた蛍光シグナルは細胞質に移動する。細胞質の蛍光シグナル強度は点突然変異を有するTDP-43では野生型と比較して明らかな低下を示した。しかし一方で、TDP-43が細胞内でどの様にmRNAを輸送しているのかは全くの謎であった。その輸送には細胞内のどの様なタンパク質が関与し、樹状突起や軸索輸送を担っているのかを突き止める必要があった。しかし、TDP-43タンパク質は単体では他のタンパク質とほとんど相互作用がみられず、これまで輸送の分子機能はほとんど解っていなかった。今回、TDP-43とG4のコンプレックスを用いて捜索する事で、微小管関連タンパク質を同定する事に成功した。この様な結果はこれまでに例がなく、今後新しい結果に繋がると期待できる。しかし、これまで全く知られていなかった現象の解明により、これまでの誤って知られていた報告とは一致しない点があったため、本計画の進展に反して、投稿した学術論文による受理に困難が伴っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで全く知られていなかった現象の解明により、これまでの誤って知られていた報告を修正する内容となっており、投稿した学術論文による受理に困難が伴っている状況である。本年度は早急な結果の発表が必要であるとともに、得られた結果の更なる応用に重点を置く。具体的にはTDP-43タンパク質の結合領域が患者から得られた点突然変異により結合するRNAの構造がどの様に変化するかを構造学的手法を用いて解析する。現在既に、変異タンパク質の精製は終了しており、円偏光二色性の確認実験は早期の段階で終了できる見込みである。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本課題の研究結果を誌上で発表するため、投稿中であるが、論文の受理が大幅に遅れており、年度を跨ぐことになった。その為の実験消耗品や投稿費などに充てる予定である。
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