| 研究課題/領域番号 |
17K07297
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (90207267)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 筋小胞体 / カルシウムポンプ / 界面活性剤 / 可溶化 / リン酸化中間体 / Ca2+結合 / 共同性 |
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| 研究実績の概要 |
ウサギ骨格筋から調製した筋小胞体ベシクル（SRV）を用い、カルシウムポンプを界面活性剤 lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG)で可溶化してその影響を調べた。その結果、LMNG 可溶化によりCa2+-ATPase 活性が大きく低下した。このとき可溶化ポンプでは、EP 分解（EP 異性化を含む）の速度は殆ど低下しなかった。そこで、非リン酸化中間体の反応段階について調べた。EP 形成が阻害されていないとき、EGTA 存在下のポンプ（E2 状態）にCa2+とATP を同時に加えてEP を形成させると、その速度はリン酸化より著明に遅いCa2+結合を反映する。このとき0.1 mM Ca2+ + 0.01 mM ATP では、LMNG 可溶化ポンプのEP 形成速度は非可溶化SRVと比べて大きく低下していた。また、そのCa2+濃度依存性は、非可溶化SRV に比べて、大きく高濃度側にシフトし、低親和性を示した。従って、可溶化によりCa2+結合が抑制されていた。0.01mM Ca2+にてポンプあたり1個のCa2+が高親和性に結合していた。次にProteinase K によるポンプの限定分解パターンをみた。非可溶化ポンプではEGTA 存在下のE2 状態でM2 上部のLeu119 が切断されて95kDa のバンドが検出されるが、Ca2+が結合したCa2E1 状態では消失する。ところが、LMNG 可溶化ポンプではEGTA 存在下でも95kDa のバンドが検出された。以上の結果から、LMNG 可溶化ポンプではE1 状態が強く安定化されていること、2個目のCa結合親和性が低くなっていることが示された。これより共同的Ca結合過程の構造変化を詳しく解析できる道が開けた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
カルシウムポンプを界面活性剤 lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG)で可溶化してその影響を調べた。この界面活性剤はEPの形成から分解までの速度は殆ど膜結合型のものと同じであり、この反応段階の解析での有効性が明らかになった。また、0.01mM Ca2+にてポンプあたり1個のCa2+が高親和性に結合し、2個目の結合親和性が低くなっていた。これらの成果より、Ca結合過程の構造変化を詳しく解析できる道が開けた。したがって、本研究がおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
カルシウムポンプを界面活性剤 lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG)で可溶化してその影響を調べた。この界面活性剤はEPの形成から分解までの速度は殆ど膜結合型のものと同じであり、この反応段階の解析での有効性が明らかになった。また、0.01mM Ca2+にてポンプあたり1個のCa2+が高親和性に結合し、2個目の結合親和性が低くなっていた。これらの成果をもとに、Ca結合過程の構造変化を詳しく解析する。また、Ca2+輸送の鍵となるEPの異性化段階の解析も予定通りおこなう。界面活性剤で可溶化し、散乱の少ない条件で酵素構造変化の解析をおこなう。また、この界面活性剤存在下のHPLCで他のタンパク質との相互作用解析もおこなう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
界面活性剤を用いた実験で好ましい結果が得られたため、そちらの実験を優先したため。これにより、部位特異的変異導入に使用する経費が予定より減少した。
今後、予定通り、部位特異的変異導入も行っていくので予定予算を使用する。
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