| 研究課題/領域番号 |
17K07302
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
本田 郁子 (小山郁子) 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任講師 (10447948)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | オートファジー / オートファゴソーム / 膜分裂 / ESCRTタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
オートファゴソーム膜の閉鎖を評価する方法として、電子顕微鏡法を利用した３次元オートファゴソーム形態情報を取得ことが可能な Array Tomography を実施した。また、Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) の試みも開始した。蛍光標識した形成過程のオートファゴソームについて、膜の開閉を 50 nm（超薄切片の厚さ）の精度で判定できるようになった。
また、オートファゴソーム膜の閉鎖を評価するための生化学的な方法として、昨年度条件検討をした GFP cleavage アッセイ（GFPで標識したオートファゴソームを proteinase K で限定分解する方法）を重点的に行った。膜の分裂のための機械因子として知られる ESCRT タンパク質複合体のノックアウト細胞や RNA 干渉細胞では、オートファゴソームの閉鎖に障害があることを示唆された。
膜分裂の機械因子 ESCRT タンパク質群がオートファゴソーム膜へリクルートされることの直接観察についても、さらに確実なデータを取得した。GFP 融合 ESCRT タンパク質、オートファゴソームタンパク質、リソソームマーカーの３色タイムラプス生細胞観察を行い、オートファゴソーム形成が完成する直前、オートファゴソーム膜が最後に閉鎖する部位に ESCRT タンパク質が短時間リクルートされることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は所属研究室にて新規走査型電子顕微鏡と試料作製装置の納入とセットアップ行い、オートファゴソーム３次元画像データの取得を開始した。現在のところたくさんのデータ例数取得には至っていないが、3D-Correlative Light and Electron Microscopy (3D-CLEM) の試みも開始した。この方法で、形成初期や後期のオートファゴソームを異なる蛍光色素で標識し分け、それらついて電子顕微鏡レベルの解像度で３次元構造を解析することができる。
オートファゴソーム膜の閉鎖を評価する生化学的な方法として、GFP標識した粗精製オートファゴソーム小胞を proteinase K で限定分解するアッセイを行った。未閉鎖のオートファゴソーム膜のGFPは切断され、完全に閉鎖されたオートファゴソーム膜のGFPは残留することから、オートファゴソーム膜の開閉状態を評価することが可能である。この実験から、ESCRT タンパク質複合体のノックアウト細胞やRNA干渉細胞では、オートファゴソームの閉鎖に障害があることを示唆された。
GFP 融合 ESCRT タンパク質 CHMP4b-Venus と、オートファゴソームタンパク質 SECFP-LC3、リソソームマーカー LysoTracker Red の３色タイムラプス生細胞観察を重ねて行った。昨年度は検出頻度が低かったが、オートファゴソーム形成が完成する直前、膜が最後に閉鎖する部位において ESCRT タンパク質が短時間リクルートする場面の検出を重ねた。これらのタンパク質がオートファゴソーム膜閉鎖に関与する可能性が高い。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請書の通り、前年度に検討したオートファゴソームの開閉を検出する方法を用いて、解析を行う。平成29年度に計画されていたオートファゴソーム膜の内膜と外膜を区別する方法の確立については引き続き保留し、本年度セットアップが完了した Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) の方法を駆使し、オートファゴソーム膜の開閉について構造学的に解析を中心にすすめる。
生化学的アッセイについては、proteinase K を用いたGFP-cleavage アッセイだけでは不十分な可能性があるため、この方法の最適化を再検討することと平行して、別のアッセイ方法を試みる。昨年度試験できなかった酸性バッファーで未閉鎖オートファゴソームの内部のGFPを消光させる方法について検討する。酸性バッファーの方法はGFPが酸性下で消光する性質を利用している。完全に閉じていないオートファゴソームの穴が数ナノメートルといった小さい場合でもバッファーが通過できるため、開閉の差の検出感度が上がる可能性がある。しかし、pHの大きな変化によってオートファゴソームの保持に大きな影響を与えてしまう可能性も心配している。
ESCRT タンパク質のオートファゴソームへのリクルートの直接観察は、ESCRT タンパク質の関与を示す強力なデータとなりうるが、現在はまだ検出例が少ないことが問題となっている。より効率よく検出例を増やせるよう、後期エンドソームなどオートファゴソーム以外に局在する ESCRTタンパク質と区別する方法や、優勢阻害細胞などの利用を含み詳細に検討を引き続き進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
請求時、ESCRTタンパク質群の関与を解析するために抗体やRNA干渉試薬等を多数購入予定しており、物品費を計上した。しかし、テスト用サンプル試薬を入手することができたため、それらで試験をした上で有効な試薬のみ購入をするよう計画を変更した。テストはほぼ完了しており、次年度に必要量を注文する予定である。
実験の遂行を優先させるためにいくつかの学会参加を延期した。したがって旅費の一部も次年度に使用する予定である。
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