| 研究課題/領域番号 |
17K07309
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
嶋田 睦 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (70391977)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 蛋白質 / エンドサイトーシス / X線結晶解析 / 電子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
クラスリン依存性エンドサイトーシスは真核生物が細胞内に物質を取り込む仕組みであり、クラスリンと呼ばれるタンパク質が細胞膜上で格子状に重合するクラスリン重合過程から開始される。本研究は構造生物学的手法と相互作用解析手法を組み合わせて、クラスリン重合過程の進行を担う鍵となるタンパク質群の相互作用の構造的基盤を確立し、クラスリン重合機構を解明することを目的とする。前年度までにAP-2複合体のα-adaptin appendageドメイン (α-appendageドメイン) とEps15の約60 残基の領域の複合体の結晶構造を決定し、等温滴定熱測定を用いた変異体解析により個々の相互作用部位の結合への寄与の程度を解明した。これによりクラスリン重合に伴いEps15がクラスリン格子の辺縁部に局在し、そこでクラスリン重合を促進する機構についての新規モデルを構築した。
当該年度はさらにEps15やFCHo1、SGIP1などのクラスリン重合因子が膜上でどのように会合しているかを検討するために脂質単分子膜を直接電子顕微鏡用グリッドに張り、その上でのタンパク質の会合を直接観察する系の構築を試みた。既に電子顕微鏡用グリッドに直接張った脂質単分子膜上における、コントロールの膜結合タンパク質の会合の様子を電子顕微鏡による負染色像として直接観察することに成功している。現在Eps15、FCHo1、SGIP1の全長タンパク質試料を調製中であり、これらが調製出来次第、これらのタンパク質の膜上での会合状態の観察を行う予定である。また結晶構造や等温滴定熱測定で示唆された個々の相互作用部位の細胞内での意義を検討するための細胞生物学的実験と、これまでとは異なるフラグメントによる、さらなる相互作用解析実験のための試料調製を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度までにAP-2複合体のα-appendageドメインとEps15の約60 残基の領域の複合体の結晶構造を決定し、等温滴定熱測定を用いた変異体解析により、結晶構造解析によって判明した相互作用部位の結合への寄与の程度を解明した。またこれらの構造機能解析の結果に基づき、クラスリン重合に伴いEps15がクラスリン格子の中央部のAP-2複合体から解離し、クラスリン格子の辺縁部に移動し、辺縁部でさらにクラスリン重合を促進する機構についてのモデルを構築した。
当該年度はこれらの結果をまとめ、論文投稿を行ったが不採択となった。その後再投稿を目指すため、査読コメントに対応できる細胞生物学実験をドイツの共同研究者と計画し、細胞内におけるEps15とAP2-複合体の各結合部位の相互作用の細胞内での意義を検討するための複数のコンストラクトを作成した。また別の査読コメントに対応するため、さらなる相互作用解析に向けたタンパク質試料調製を進めた。
またEps15、FCHo1、SGIP1などのクラスリン重合因子の膜上における会合状態を検討するため、電子顕微鏡用グリッドに直接張った脂質単分子膜上でのタンパク質の会合を電子顕微鏡により直接観察する系を確立した。現在Eps15、FCHo1、SGIP1の全長タンパク質試料の調製を進めている。
以上のように当該年度は論文再投稿に向けての実験と、将来発展の見込めるクラスリン重合過程の電子顕微鏡による直接観察の実験準備を着実に進めたため、達成度を概ね順調に進展しているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はまずEps15、FCHo1、SGIP1の全長タンパク質を調製し、クラスリン重合において最初に膜上で形成されるEps15とFCHo1あるいはSGIP1の会合体の膜上における電子顕微鏡による直接観察を目指す。さらに形成される会合体がサブトモグラム平均化や単粒子解析などの手法により高分解能の構造解析が見込める場合は適切な手法を用いてこれらの会合体の分解能の向上を目指す。さらにα-appendageドメインやAP-2複合体、クラスリン等をこの系に加え、試験管内でのクラスリン重合過程の再構成とその電子顕微鏡による直接観察のための基盤作りも進める。またこれと並行してこれらのタンパク質の溶液中における会合状態の電子顕微鏡による観察も試み、高分解能での構造解析が目指せる場合にはそれを目指す。
さらにドイツの研究者との国際共同研究による細胞生物学的実験により、Eps15とAP-2複合体の結合における各結合部位の細胞内での意義について検討するとともに、モデルを補強するためのさらなる相互作用解析実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成30年度は論文投稿を行ったため、比較的高額の論文掲載料を確保する必要性が生じたが不採択となり、再投稿が次年度にずれ込んだことで、その分の予算が次年度使用額の一部となった。また研究の進展に伴い実験の優先順位が変化し、想定よりも消耗品の必要量が少なくなったことも次年度使用額が生じたことにつながった。繰り越す次年度使用額は、主に論文掲載料と消耗品費、また研究の進展に伴い必要になる高速原子間力顕微鏡や電子顕微鏡などの機器を使用するための他機関実験のための旅費として使用予定である。
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