| 研究課題/領域番号 |
17K07318
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
松波 秀行 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 研究員 (80444511)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 細菌べん毛 / シャペロン / 分子軸受け |
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| 研究実績の概要 |
細菌べん毛のPリングはペプチドグリカンに結合し、高速で回転するロッドを支える分子軸受け、Pリングはシャペロンタンパク質FlgAに依存的に形成する。フックやフィラメントが正しく構築されるためには、Pリングの形成は必須である。本研究では、Pリングを構成するタンパク質FlgIに特異的に作用するFlgAの構造機能解析から、Pリングの形成機構を分子レベルで明らかにし、Pリングの構造から高速で回転するべん毛モータの滑らかな回転機構を解明することを目的とする。初年度には、サルモネラ菌のFlgIの結晶化と機能ドメイン構造の解析およびFlgAの機能ドメイン構造の解析を計画した。FlgIと相同性が高いタンパク質は見つかっておらず、これまでにFlgIのX線結晶構造解析の例もないので、べん毛モータの回転機構を解明するためにはFlgIの構造機能解析が必須であると考えた。本来、FlgIはペリプラズムに移行して成熟型となりPリングを形成するが、FlgIは過剰に発現させると封入体として蓄積する。そこで、FlgI の安定性と生産性を向上させるために、FlgIのN末端にpelBタンパク質由来のペリプラズム移行シグナル配列と精製用のアフィニティータグを付加した。大腸菌で低温条件下で発現誘導を行うと、FlgIは可溶性画分から回収され、ペリプラズムに移行していることが示唆された。しかし、これまでのところFlgI の結晶化には成功していない。一方、FlgIの機能ドメインの解析のために、FlgIのNまたはC末端をそれぞれ欠失させた遺伝子を作成し、タンパク質の発現の有無を大腸菌で確認した。発現したFlgIを含む大腸菌の粗抽出液を電気泳動で分離後、膜上に転写させてファーウエスタンブロット解析法によってFlgAとの結合能を評価した。また、FlgA の変異導入によって、FlgAの機能を担う重要なアミノ酸残基の候補を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
FlgI は通常の培養温度で大腸菌で発現させると、封入体として細胞内に蓄積し、ペリプラズムへの移行はほとんどおこらない。FlgIのタンパク質発現条件は最適化したが、これまでのところFlgIの結晶は得られていない。本来、FlgIは環状化してPリングを形成するので、全長FlgIでは結晶成長よりも環状化が優勢になる可能性もある。そこで、FlgIとしての安定化を期待してFlgAとの共発現を試みた。FlgAは本来のシグナル配列を残したままFlgIと共発現させ、ペリプラムでの複合体形成を目指した。FlgIのN末端に付加したヒスチジンタグを利用してアフィニティー精製後、サイズ排除クロマトグラフィーによってFlgIとFlgAを含む画分を確認できた。今後、FlgI/FlgAの複合体として結晶化の検索をできるようになった。FlgIの機能ドメインの解析では、FlgIのN末端を欠失させてもFlgAとの結合に変化は見られず、FlgIのC末端側にFlgAとの結合領域があることが判明したので、全長FlgIでは結晶化が難しいので、FlgAとの結合領域の結晶化の道筋がついた。FlgAのC末端側を欠失させるとFlgIとの結合ができずシャペロンとしての機能が失われ、その結果べん毛はできない。FlgAのC末端側には、アミノ酸配列の相同性は低いが疎水性のアミノ酸残基が集まった部分があり、この領域のアミノ酸残基に部位特異的変異を導入し、サルモネラ菌のFlgA変異株を相補できない変異体を発見した。この疎水性アミノ酸に富む領域はFlgIとのタンパク質相互作用に関与する重要な領域であると予想している。
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| 今後の研究の推進方策 |
FlgIの機能ドメインの解析を詳細に検討するためには、FlgIを部分的に欠失させた変異型FlgIをサルモネラ菌の野生株中に発現させ、正常なべん毛形成の阻害作用の有無を調べる必要があり、FlgIのPリングの形成に関わる領域を同定することができる。変異型FlgIの可溶性の評価とFlgAとのタンパク質間相互作用を調べることで、FlgAとの結合に必要なFlgIの領域を決定し、共結晶化の成功率を高める。全長FlgIの結晶化が進まない場合、FlgAとの結合の必要な最小領域をもつFlgIの構造を決定する。FlgI/FlgAの複合体として共結晶化を試みることで、FlgI単独では難しいかった結晶の成長を促すことを期待している。FlgI/FlgAの複合体構造を決定することで、FlgIとFlgAのタンパク質間相互作用を明らかにする。FlgAには、らせん状のフィラメントやフックに結合するシャペロンとの構造的な類似点が見られないので、べん毛構築での機能的な役割について不明な点は多く、FlgIとFlgAのタンパク質認識機構をX線結晶構造解析で決めることは、Pリングの形成機構を明らかにする上で重要な課題である。FlgIの構造決定に必要な結晶化を成功させるためには、FlgIの機能ドメイン構造を反映させながら結晶化に適した候補を広く探り結晶化を継続する。サルモネラ菌のFlgIで結晶化が進まなかった場合、当初の実験計画に示した通り、サルモネラ菌のFlgI以外に好熱菌など他の細菌由来のFlgIの結晶化検索を実行する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度に設備備品として購入を予定していた計算機の支出を次年度以降に繰り越したため差額が生じているが予定通り購入を行う。また、初年度に予定していた学会への参加とX線回折実験の旅費の支払いがなかったため差額が生じている。
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