研究課題
細菌べん毛のPリングは回転軸であるロッドの分子軸受けとしてべん毛の回転を支える重要なサブ複合体である。Pリングの形成には特異的な分子シャペロンFlgAが関与しており、ペリプラズム領域でPリングの構成タンパク質であるFlgIにFlgAが結合することでPリングの形成が制御されている。FlgAに依存したPリングの形成機構はこれまでほとんど理解されていない。そこで、FlgIとFlgAの構造からPリングの形成機構を分子レベルで明らかにする課題に取り組んでいる。これまでのところ、サルモネラ菌FlgIもしくはFlgI/FlgA複合体からの結晶は得られていない。サルモネラ菌FlgIでの結晶化に成功しない場合のために準備してきた好熱菌FlgIの結晶化スクリーニングも行っているが、サルモネラ菌FlgI と同様にX線結晶構造解析による構造決定ができるような結晶を作成するには至っていない。X線結晶構造解析法ではタンパク質の結晶化を必要とするため、これまで試料の改変や結晶化スクリーニングの条件検討に時間を要したが、本質的にFlgIは溶液中のタンパク質の自由度が高く結晶化には適していない可能性も否定できない。しかしながら、好熱菌FlgIの試料を電子顕微鏡で観察するとリング状に集合したFlgIの複合体が見出されたことから、X線結晶構造解析法では困難であってもクライオ電子顕微鏡法による構造解析が可能であると判断し、残りの研究期間内はクライオ電子顕微鏡を用いたリング状FlgI複合体に着目して構造決定を継続する。
3: やや遅れている
これまでサルモネラ菌FlgIの結晶化スクリーニングを継続してきたが、結晶化には成功していない。サルモネラ菌FlgIを単独で結晶化してX線結晶構造解析法で構造決定することは難しいと判断した。さらに、サルモネラ菌FlgIとFlgAとの複合体を調製して結晶化スクリーニングを行ってきたが、これまでFlgI/FlgA複合体の結晶化にも至っていない。サルモネラ菌FlgIは大腸菌内ではそれほど発現せず、FlgAを共発現させた場合であっても試料を調製することが難しかったことが原因の一つに挙げられる。そこで、当初の予定通り、構造解析用のタンパク質試料をサルモネラ菌FlgIから好熱菌FlgIに変更した。好熱菌FlgIを大腸菌内で発現させた場合には、サルモネラ菌FlgIに比べて発現量や溶解度の点で結晶化用試料として適していた。しかしながら、結晶化スクリーニングでは好熱菌FlgIの結晶は得られておらず、これまでのところ好熱菌FlgIの構造決定には至っていない。好熱菌FlgIとFlgAとの複合体の調製には至っていないが、サルモネラ菌由来の試料のように結晶化は容易ではない可能性がある。一方、好熱菌FlgIを精製する過程で構造解析の試料として様々な発現用コンストラクトを用意したところ、C末端にアフィニティータグを融合した場合には、好熱菌FlgIがリング状の複合体が電子顕微鏡下で観察された。精製を容易にするために付加した数残基のアミノ酸によって好熱菌FlgIのPリングの形成がより安定化された可能性が示唆された。これらの結果から、今後はC末端にアフィニティータグを融合した好熱菌FlgIから得られたPリングをクライオ電子顕微鏡法による構造解析の対象として構造解析を継続することが最適であると判断した。
X線結晶構造解析法によるFlgIとFlgI/FlgAの複合体構造の決定のために引き続き結晶化を試みてきたが、これまでにX線結晶構造解析実験に適した結晶は得られていないため構造決定には至っていない。最終年度を繰り越してクライオ電子顕微鏡法による構造解析を中心に課題を進める判断をした。従来、X線結晶構造解析法のためのタンパク質の調製方法はクライオ電子顕微鏡法において構造解析を進める場合でも大きく変更する必要は無く、研究課題の基本的な方針は従来のX線結晶構造解析法による研究の進め方を踏襲することができる。Pリングを構成するFlgIは単量体として分子量40 kDa 足らずのタンパク質なので、クライオ電子顕微鏡法で高い分解能で構造を決定できる可能性はそれほど大きくはない。一方、Pリングはおおよそ26分子のFlgIから構成される複合体で分子量は1 M Daに到達する巨大なサブ複合体であるため、クライオ電子顕微鏡で撮影した画像から単粒子解析法によって構造解析を進めることは十分可能である考えられる。サルモネラ菌や好熱菌由来のFlgIが試験管内でPリングを形成する条件を検索し、クライオ電子顕微鏡法による構造解析に適した画像を取得する。FlgI とFlgAとの結合様式を明らかにするためには、X線結晶構造解析法による構造決定が適しているが、近年のクライオ電子顕微鏡による画像取得と解析方法の改良によって、分子量が100 kDaにも満たないタンパク質の構造が報告されている。結晶化に適していないタンパク質試料であってもクライオ電子顕微鏡解析を試みることは十分に可能である。
研究成果の発表を予定していた国内および国際学会が中止となり参加を取りやめた結果、旅費の使用額に差が生じている。また論文投稿に遅れが生じていることで印刷費等の支出が予定より少なかったために差が生じている。予定していた以上に消耗品等の購入のため物品費の支出額に差が生じているが、実験計画を遂行するにあたり必要な物品の購入のための支出を最終年度にも予定している。
すべて 2020 2019
すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 1件)
Structure
巻: 28 ページ: 44-53
10.1016/j.str.2019.10.016
Biomolecules
巻: 9 ページ: -
10.3390/biom9070260
Nature structural & molecular biology
巻: 26 ページ: 941-945
10.1038/s41594-019-0301-3
