| 研究課題/領域番号 |
17K07321
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| 研究機関 | 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構 |
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研究代表者 |
安達 成彦 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 特別助教 (70707489)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 分子進化 / 構造生物学 / 転写 / 複合体 |
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| 研究実績の概要 |
転写開始反応はゲノムDNAからの遺伝情報の読み出しにおける最初の反応である。転写基本因子TFIIDは全遺伝子の9割の発現制御に関わり、転写開始において中心的な役割を果たす因子であるが、15種類のサブユニットから構成される分子量1MDaの複合体であるため、高分解能の立体構造は未だ解析されていない。応募者はこれまでにTFIIDの大量精製法を確立してきたが、TFIID単独では形状が不安定なため、さらに5種類の相互作用因子を精製した。次の問題は因子を混合する順序だが、我々は近年開発した分子進化の新しい指標に基づき、進化の過程で誕生した順に混合するという着想に至った。本研究では、A. TFIIDの結晶化と結晶構造解析、B. 分子進化的解析、C. TFIIDを含む複合体の再構成と立体構造解析、を行う。
平成30年度は、A.C.に注目して研究を進めた。TFIIDは分子量が巨大でサブユニット数も多い複雑な複合体であるため、結晶化だけでなく、クライオ電子顕微鏡による解析も進めた。平成30年4月に、200kVのクライオ電子顕微鏡（Talos Arctica, Falcon3）がKEKに導入されたことを受けて、まずはその立ち上げを行なった。12月には110kDaのタンパク質を2.85angstrom分解能で決定することに成功し、立ち上げが完了したと考えている。現在、KEKクライオ電顕の装置責任者として共同利用を推進しつつ、TFIIDと相互作用して形状を安定化するRNA polymerase IIのクライオ電顕解析を行い、現在、8angstrom分解能での単粒子解析に成功している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
平成30年度は、TFIIDなどの巨大複合体の立体構造解析に必須な技術である、クライオ電顕の立ち上げに成功したので、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
A.TFIIDの結晶化と結晶構造解析:結晶が得られ次第、PFやSPring-8等の放射光実験施設を活用して回折データの収集を行う。また、KEKにおいてクライオ電顕が立ち上がったので、積極的に電子顕微鏡観察を行い、良い像を得られればそのまま単粒子解析に進む。
B.分子進化の新しい指標を利用して、TFIIDを含む複合体の集合順序を予測:引き続き、dDRに基づく解析を通して、分子集合や構造解析にヒントが得られないかを探る。
C.TFIIDを含む複合体の再構成と立体構造解析:B.の結果を受けて、dDR値を利用した分子進化的解析に基づいてTFIIDとその他の因子を混合する。もし、総当たりで検討するなら、単純に考えても7x6x5x4x3x2の5040通りを試みないといけないし、二者同時・三者同時の可能性を考慮するとさらに組み合わせが増える。本研究課題ではdDR値を踏まえてpolII,TFIIBなどを先に混合してコアを作り、その後TFIIDや他の因子を加えることとする。複合体形成については、熱安定性測定・動的光散乱・X線小角散乱・電子顕微鏡観察を組み合わせて確認し、得られた情報に基づいて、TFIIDを含む複合体の再構成・結晶化およびクライオ電顕観察を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成30年度はクライオ電顕の立ち上げに時間を費やしたため、次年度使用額が生じた。平成31年度は、精製と電顕観察に集中できるので、次年度使用額は主に精製の際に使用するTEV proteaseの購入に充てることとする。
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