| 研究課題/領域番号 |
17K07327
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
船越 祐司 筑波大学, 医学医療系, 助教 (30415286)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 低分子量G蛋白質Rab / 細胞内膜輸送 / RabGAP / TBC蛋白質 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、RabGAPドメインであるTBCドメインを有しながら、GAP活性に必須のアミノ酸を欠くユニークなRabGAP（非定型RabGAP）に着目し、クラスリン非依存性に取り込まれる膜蛋白質（CIEカーゴ）の細胞内輸送における機能解明を目的とする。平成29年度までに、上記のような特徴をもつTBC1D3、TBC1D24およびTRE17がCIEカーゴの輸送に関わることを見出しており、本年度は、これら非定型RabGAPの機能解析を中心に研究を進め、以下の結果を得た。
これまでに、TBC1D3およびTBC1D24が、CIE カーゴの輸送経路に特徴的なチューブ様リサイクリングエンドソーム（TRE）の形成を促進することを見出している。本年度は、そのメカニズムの解析を行い、両者が、TREの形成やCIEカーゴのリサイクリングにおいて重要なRab22aと結合することを明らかにした。さらに、Rab22aをHeLa細胞においてノックダウンするとTBC1D3、TBC1D24によるTRE形成促進作用が抑制されること、TBC1D3を過剰発現するとRab22aの活性が上昇する一方で、TBC1D24ではRab22aの活性促進はみられないことを見出した。これらの結果より、TBC1D3とTBC1D24はRab22aを介してTREの形成を促進するが、両者によるRab22aの制御メカニズムは異なることが示唆される。これらに加え、TBC1D24が、細胞接着に関わる因子の細胞膜上での発現を調節し、細胞の遊走に関わることを見出している。
TRE17については、そのTBCドメインが細胞内局在を制御していることを明らかにするとともに、TBCドメインを介して局在を制御する因子の探索を行い、その候補を同定した。また、TRE17がある種のCIEカーゴのリサイクリングを促進することにより、癌細胞の浸潤を促進することを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、平成29年度にTRE形成の制御に関与することを見出したTBC1D3、TBC1D24、および、先にCIEカーゴの脱ユビキチン化を介してそれらのリサイクリングを促進することを報告していたTRE17について、それぞれの機能制御の分子メカニズムを明らかにすることを計画の一つとしていた。また、TBC1D3、TBC1D24、TRE17の他に、特徴的なRabGAPドメインをもつ非定型RabGAPが複数あることから、これらのRabGAPの機能解析も計画していた。
TBC1D3、TBC1D24による輸送制御のメカニズムについては、上記に記載のように、下流で働くRabの同定やその活性化といった成果を上げている。TRE17についても、その機能発現にはTRE17の細胞内局在が重要であり、局在を規定する因子の候補を同定している。さらに、平成31年（令和元年）度に予定していた、「CIEカーゴの輸送制御を介して、TBC1D3、TBC1D24、TRE17がどのような細胞機能に関与するのか」という課題にも取り組み、TBC1D24およびTRE17が、それぞれ特定のCIEカーゴの輸送制御を介して、細胞の遊走、癌細胞の浸潤に関わることを明らかにしている。このように、上記3つのRabGAPの解析については、計画以上に進捗しているといえる。
一方で、TBC1D3、TBC1D24、TRE17の解析を優先するために、他の非定型RabGAPの機能解析については、CIEカーゴ輸送において重要な役割を果たす低分子量G蛋白質Arf6との相互作用を検討するにとどめ、平成31年度以降に実施することとした。
以上のように、一部の計画変更はあったものの、本研究課題で計画している実験は概ね順調に実施し、一定の成果を上げていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度は、これまでに成果を上げてきたTBC1D3、TBC1D24、TRE17の解析について、さらに以下の解析を加える。
TBC1D3：Rab22aを活性化することによりTREの形成を促進することを明らかにしているが、通常低分子量G蛋白質はGEFによって活性化されることから、TBC1D3がどのようなGEFを介してRab22aを活性化するのかを明らかにする。また、TBC1D3は癌細胞の増殖や腫瘍形成に関わることが報告されていることから、TBC1D3がどのようなCIEカーゴの輸送を調節し、細胞の癌化に関わるのかを明らかにする。
TBC1D24：Rab22aを介してTRE形成を制御することを明らかにしているが、Rab22aの活性化促進はみられなかったことから、メカニズムの解明を目指す。TBC1D24のRab22a細胞内局在への影響や、他のTRE制御因子との機能的な関係を明らかにする。また、TBC1D24は、神経細胞や癌細胞の遊走に関わることから、平成30年度に見出した接着因子の輸送制御の知見をもとに、遊走制御メカニズムを明らかにする。
TRE17：TRE17の局在を制御する候補因子が、実際にTRE17の局在を制御することによりCIEカーゴの輸送に関わるのかを検証する。また、TRE17は腫瘍の増大や癌細胞の浸潤に関わっているが、上記のように、TRE17が特定のCIEカーゴのリサイクリングを促進することによって癌細胞の浸潤を促進することを細胞レベルで明らかにしている。このシグナル系が、in vivoにおいても癌細胞の浸潤・転移を促進するのかをマウスを用いて検証する。
さらに、上記TBC1D3、TBC1D24、TRE17のとは別の非定型RabGAPについてもCIEカーゴ輸送への関与を検討していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初平成30年度に予定していた実験計画の一部を変更し、平成31年度に実施することとし、その計画に必要な経費を平成31年度に繰り越す必要性が生じたため。
平成30年度に予定していた実験は、最終年度（平成31年度）の計画と合わせて実施し、完了する予定のため、研究期間中に全て使用する予定である。
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