| 研究課題/領域番号 |
17K07344
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| 研究機関 | 国際医療福祉大学 |
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研究代表者 |
林 真理子 国際医療福祉大学, 医学部, 講師 (30525811)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | グルタミン酸 / ペリニューロナルネット / マイクログリア / アストロサイト / 興奮毒性 / ヒアルロン酸 / グルタミン酸トランスポーター |
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| 研究実績の概要 |
グルタミン酸は中枢神経系における主要な興奮性伝達物質であり、その過剰な作用は神経細胞死をひきおこす。グルタミン酸トランスポーターは興奮性シナプスに放出されたグルタミン酸を回収することによってシナプス伝達を終結させるとともに、過剰な興奮から神経細胞を守っており、その活性はヒアルロン酸の合成に依存する。二年目の計画はグルタミン酸がヒアルロン酸やペリニューロナルネットの形成を制御する、双方的な制御の関係があるかを評価するというものであった。
そこで，ラット大脳分散培養にグルタミン酸を投与して神経細胞を興奮させた際に、ヒアルロン酸やペリニューロナルネットの形成に変化はあるかを観察した。1分から30分まで、5-100μＭグルタミン酸による処理を行い、神経細胞樹状突起の損傷を微小管結合蛋白質の免疫染色でモニタリングしつつ、ヒアルロン酸結合タンパク質や、ヒアルロン酸に結合してペリニューロナルネットを形成するコンドロイチン硫酸を認識するレクチンで標識し、定量化した。しかし、再現的な変化を観察することはできなかった。
そこでヒアルロン酸が一般的に炎症反応で増加するという知見に基づき、ラット大脳分散培養にマイクログリアとリポポリ多糖を加え、ヒアルロン酸やペリニューロナルネットに影響があるかを観察した。リポポリ多糖はマイクログリアを炎症型に誘導するが、その添加は神経細胞近傍のヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸を減少させた。炎症に伴うサイトカインの変化によりヒアルロン酸の合成量が低下したか、マイクログリアによるペリニューロナルネットの貪食が起こったか、の可能性が考えられる。炎症性サイトカインの添加でマイクログリアの作用を模倣できるかを検討することで、そのいずれであるかを調べることができるので、今後検討を続ける。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
グルタミン酸がヒアルロン酸の合成を制御する、双方向的な制御の可能性は否定されたが、マイクログリアの炎症反応によりヒアルロン酸の合成が制御されている可能性を示すことができた。マイクログリアの炎症はアストロサイトを炎症型に変化させるのに加え、ともに神経保護型、神経損傷型の炎症型をとることが知られている。こうしたグリア細胞の状態の違いが神経細胞を制御する分子メカニズムの全容は不明であるが、ヒアルロン酸合成やペリニューロナルネット形成が関与している可能性がある。今後神経シナプス構造などに影響があるかなどにも着目しながら研究を進める必要がある。
本研究の成果をまとめて投稿し、査読、修正に対応している。ヒアルロニダーゼの基質特異性などを慎重に評価することなどを要求されたので、必要な追加実験を行い、修正後再投稿し、査読を受けている。
この培養系を用いて、神経保護作用のある化合物ライブラリーのスクリーニングを視野に創薬機構のコンサルテーションを受けた。多数の化合物のスクリーニングにあたっては、サンプル間のばらつきを抑えたうえで感度のよい培養条件を用意する必要があるので、そのための条件検討を始めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
マイクログリアの炎症状態がヒアルロン酸の合成やペリニューロナルネットの形成に影響することがわかったので、そのプロセスを明らかにする。マイクログリアやアストロサイトが神経保護型か、神経損傷型かについて、マーカーとなる抗体で標識して評価する。神経細胞への影響については、これまで用いている樹状突起の抗体染色に加え、プレ・ポストシナプスマーカーの標識、やカルシウムイメージングによる神経活動評価、神経活動のマーカーとなるcFosやCREBによる標識を併用して評価していく。
この培養系を用いた創薬スクリーニングのための条件検討を進め、まずは既存薬ライブラリー1800によるスクリーニングを実施し、ヒアルロン酸合成や神経細胞の状態改善、アストロサイトの神経保護作用増強作用を持つ化合物を得ることを目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在投稿中の論文の査読に必要な研究費，掲載料の支出に対応する必要があるが，予定より遅れたため，その費用を繰り越した．今年度は研究計画に沿って研究と投稿を進めるとともに，本研究中にアストロサイトの形態成熟に関する新たな知見があったこと、マイクログリアによるヒアルロン酸制御が明らかになったことを受け、最終年度でもあるので論文投稿と査読対応を進めていく。
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