| 研究課題/領域番号 |
17K07349
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
米田 敦子 東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (80590372)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 悪性黒色腫 / 薬剤耐性 |
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| 研究実績の概要 |
悪性黒色腫は皮膚癌が原因の死亡の 80% を占め、日焼けが関連しない黒色腫の約半数の症例では BRAF 遺伝子に活性化変異がある。そのため悪性黒色腫患者ではBRAF 阻害剤が奏功するが、すぐに薬剤耐性が生じる事が問題となっている。我々は、BRAF 阻害剤耐性株と感受性株の比較により、細胞外マトリックス受容体インテグリンシグナルに関わる分子の糖鎖修飾に顕著な差を示唆する予備的結果と、特定の脂質が耐性株の細胞膜に多いことを示唆する予備的結果を得ていた。本研究では、BRAF 阻害剤耐性悪性黒色腫の薬剤耐性に、細胞表面糖鎖の改変、細胞膜脂質の改変を介したインテグリン生存シグナルの制御が重要であるとの仮説を検証することを目的とする。本研究より、BRAF 阻害剤耐性悪性黒色腫の新規標的の発見が期待でき、治療応用、阻害剤デリバリーを念頭にした創薬開発への基盤形成を目指す。平成２9年度はBRAF阻害剤感受性株と耐性株で発現量が異なるインテグリンシグナル関連因子の分子特性解析を行った。天然型と糖鎖修飾変異体の解析と、レクチン染色により、感受性株と耐性株において当該分子の糖鎖修飾が変化することを明らかにした。感受性株に発現することで、薬剤処理下でのメラノーマ細胞の増殖がさらに低下することを見出した。耐性株と感受性株で、細胞膜での量が異なることが示唆された脂質を検出するプローブを作成し、その特異性を確認した。以上の結果の一部をポスターにより学会で発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
BRAF阻害剤感受性株と耐性株でのインテグリンシグナル関連分子の分子特性の差異を解析した。耐性株で発現量が減少しており、感受性株と耐性株での分子サイズが異なる分子を同定した。タグ付き天然型と糖鎖修飾部位に変異をもつ変異体をコードするcDNAを作成した。これらを２種類のヒトBRAF変異メラノーマ細胞に導入し、免疫沈降と糖鎖遊離酵素消化を用いて、感受性株の薬剤処理により糖鎖修飾が変化することを明らかにした。これらメラノーマ細胞の内在性分子の糖鎖構造が薬剤処理によって変化することを、レクチン固定化ゲルによるプルダウンとウエスタンブロット解析により明らかにした。これら分子の細胞内での局在を解析したところ、糖鎖修飾が分子の細胞膜局在に重要であることが明らかとなった。感受性株に発現することで、薬剤処理下でのメラノーマ細胞の増殖がさらに低下することを見出した。これらの結果の一部を関連学会でポスターによる発表を行った。予備的に耐性株の細胞膜で増加していると示唆された脂質を検出できるプローブを作成し、その特異性を確認した。以上のことより、実施計画と目標は概ね順調に達成できたと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
鍵となる糖転移酵素の遺伝子発現レベルを感受性株と耐性株で比較する。候補となる酵素の遺伝子を導入あるいは抑制し、インテグリンシグナル関連因子の細胞内局在を FACS、細胞染色、細胞分画により解析する。糖鎖改変によるインテグリンシグナルへの影響をシグナル分子のリン酸化解析、活性型インテグリン認識抗体による FACSや細胞染色、細胞の生存、接着、移動能解析により明らかにする。細胞膜脂質の増加や減少処理により、インテグリンの活性状態、シグナルが変化するかについて同様に解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
比較的安価な試薬を用いる分子生物学実験が多かったこと、予定していたほどの委託解析を行わなかったためである。
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