| 研究課題/領域番号 |
17K07376
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| 研究機関 | 国立研究開発法人情報通信研究機構 |
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研究代表者 |
大岩 和弘 国立研究開発法人情報通信研究機構, 未来ICT研究所, 主管研究員 (10211096)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ダイニン / 鞭毛 / 原子間力顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
真核生物の鞭毛・繊毛は様々な生理機能に関与する重要な細胞小器官である。この鞭毛・繊毛は、9本の周辺微小管が1対の中心小管を取り囲む「9+2構造・軸糸」を基本構造としている。周辺微小管上に規則的に配列したダイニン複合体「ダイニン腕」が隣接する周辺微小管との間で滑り運動を引き起こし、これが時間的・空間的に制御されることで、繊毛・鞭毛は規則的な波打ち運動を行なう。本研究では、協調された波打ち運動創出のメカニズムを理解するために、軸糸構造という立体的拘束条件の中で起きる構成要素間での協調ダイナミクスを分子レベルで観察することを目指している。
生理学的条件下の軸糸内で、周辺微小管が滑り運動を行う際のダイニン腕の協動を観察するために、高い空間分解能でダイニン腕を実像として可視化できる液中高速原子間力顕微鏡（AFM）を用いている。実験材料はクラミドモナス鞭毛軸糸とその軸糸ダイニンである。
劈開したマイカ表面に吸着させた鞭毛試料にAFMの探針を接近させる。タッピングモードで振動している探針の振動状態の変化で、微細構造の映像化を行った。高速AFMにおいて、観察する試料のサイズが大きくなると、微細構造の観察の難しくなる。直径200nmの軸糸の中にある24nm周期のダイニン腕の構造を観察することは容易ではない。そこで、まず、単離精製したダイニン分子のヌクレオチド依存的な構造変化を生理学的条件下で計測した。球状のモータ領域から2つの棒状構造が突出するダイニン分子に特徴的な構造を確認した。これは、電子顕微鏡陰染色法によって確認した軸糸ダイニンの構造と同一であった。次に、脱膜軸糸の中のダイニン腕の構造の可視化を目指した。通常のトポグラフィー観察では、ダイニン分子の詳細を可視化することはできなかったが、探針の運動と駆動信号との位相差を使った位相イメージングで外腕ダイニンの詳細が観察できるようになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、ダイニン分子の可視化に成功し、脱膜鞭毛の軸糸の可視化と位相イメージングに成功するなど研究計画に沿っておおむね順調に進んでいると判断する。
一方で、AFMのマイカ基板表面への生物試料吸着に関してその吸着効率を改善する必要がでてきた。特に、鞭毛軸糸のマイカ基板表面への吸着が弱く、軸糸の高効率での観察が困難であった。平成29年度は吸着効率を向上させるための表面処理剤としてポリリジンを利用したが、大きな改善にはつながらなかった。今後、シランカップラや脂質膜を利用してマイカ基板表面の状態を調製する予定である。
また、ダイニンの活性化には光開裂ATPアナログの導入を行った。低濃度ATP存在下での観測を併用したものの、試料へ探針をアプローチさせてからイメージングを開始し、最適試料を探索するという基本操作が煩雑であるため、観察のためのすべての条件が整ったところでのATPの光開裂でダイニンの活性化を行うことが有効な手段となる。このために、平成30年度には、平成29年度に導入を進めた光刺激装置をより積極的に活用することを予定している。
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| 今後の研究の推進方策 |
鞭毛軸糸やダイニンのAFM観察において、試料の発見頻度が低いという問題が生じている。このために、AFMのマイカ基板表面への生物試料吸着に関してその吸着効率を改善する必要がでてきた。特に、鞭毛軸糸のマイカ基板表面への吸着が弱く、軸糸の高効率での観察が困難であった。平成29年度は吸着効率を向上させるための表面処理剤としてポリリジンを利用したが、大きな改善にはつながらなかった。今後、シランカップラや脂質膜を利用してマイカ基板表面の状態を調製する予定である。
また、ダイニンの活性化には光開裂ATPアナログの導入を行った。低濃度ATP存在下での観測を併用したものの、AFM探針を試料へアプローチさせてからイメージングを開始し、最適観察領域を探索するという基本操作が煩雑であり、時間がかかる。このことから、観察のためのすべての条件が整ったところでのATPの光開裂でダイニンの活性化を行うことが有効な手段と判断している。平成30年度には、本年度導入を進めた光刺激装置をより積極的に活用することを予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【次年度使用額が生じた理由】実験の過程の中で壊れやすいAFM探針を購入するために消耗品費を見積もっていたが、探針が汚れなどで使用不能になる頻度が当初予想していたものより少なかった。このため消耗品購入の経費が予定より抑えられたことによる。
【次年度の使用計画】 使用頻度が上がると予想されるAFM探針の購入と光開裂型ATPアナログの購入に充てる。
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