Rab2の細胞内ターゲティング過程の再構成と分子機構解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K07379
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 加納 ふみ 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 准教授 (10361594)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 再構成 / Rabタンパク質 / セミインタクト細胞 / ERGIC / ターゲティング

研究実績の概要

Rabファミリーは～60種類のタンパク質からなる巨大なsmall GTPaseファミリーであり、主にオルガネラにおける細胞内膜輸送過程で分子スイッチとして機能する。各Rabタンパク質はそれぞれ異なるオルガネラや細胞内局在を示すが、その細胞内局在は自身のタンパク質配列によるものではなく、相互作用するタンパク質によって決定されると考えられている。本研究では、Rabファミリータンパク質の一つRab2のER-Golgi intermediate compartment (ERGIC)ターゲティングアッセイを構築し、その局在化メカニズムを明らかにすることを目的とする。今年度は、平成２９年度に構築した細胞膜を透過性にしたセミインタクト細胞によるRab2のERGICターゲティング過程の再構成系を用いて、ターゲティング制御因子の探索を行った。Rab2のERGICターゲティングは細胞質非依存的であったため、ターゲティング制御因子はセミインタクト細胞内にあることが予想された。そこで、セミインタクト細胞のライセートからGreen fluorescence protein(GFP)あるいはGFP-Rab2に結合するタンパク質を免疫沈降法により回収した。SDS-PAGE後ルビー染色（タンパク質染色）を行い、GFP-Rab2存在下で特異的に検出されるバンドを切り出し、質量分析を行った。その結果、Carbamoyl-phosphate synthase [ammonia] mitochondrial, pyruvate kinase PKMが同定された。これらのタンパク質について検証を行ったが、Rab2との結合が検出されない、細胞内局在がERGICではなくミトコンドリアである、などの結果が得られたため、Rab2ターゲティング制御因子である可能性が低いと考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

前年度に構築したアッセイ系で得られた結果をもとに、免疫沈降法と質量分析によるターゲティング候補因子の抽出・同定を行った。残念ながら、抽出されたタンパク質群はRab2のERGICターゲティング制御因子でない可能性が高かったが、進捗は概ね計画通りである。

今後の研究の推進方策

現方法での免疫沈降法では、Rab2のERGICターゲティング制御因子を同定することができなかった。ターゲティングに必要な因子が膜タンパク質など可溶化が難しいタンパク質である可能性もあるため、可溶化バッファーや条件の検討を行い、再度免疫沈降法による候補因子の抽出を行う。また、すでにRab2との結合が報告されている因子にも注目し、Rab2のERGICターゲティングへの関与を構築したアッセイ系やその他の細胞生物学的実験により検証する。具体的には、Rab2結合因子に対する抗体によるRab2のERGICターゲティング阻害や、RNAiによる発現抑制のRab2局在への影響などを調べる予定である。

次年度使用額が生じた理由

今年度は概ね計画通りに質量分析の外注や生化学的実験に使用したが、前年度の繰越分もあったため、次年度使用分が発生した。この次年度使用分については、条件検討を行ったあとの追加の質量分析外注費や、その他の細胞生物学的、生化学的実験に使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Phosphatidylinositol-3-phosphate-mediated actin domain formation linked to DNA synthesis upon insulin treatment in rat hepatoma-derived H4IIEC3 cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Kano, F., Murata, M.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Mol. Cell Res. 巻: 1866 ページ: 793-805
  • DOI: doi:10.1016/j.bbamcr.2019.02.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Changes in the asymmetric distribution of cholesterol in the plasma membrane influence streptolysin O pore formation (2019)
  • 著者名/発表者名: Ogasawara, F., Kano, F., Murata, M., Kimura, Y., Kioka, N., Ueda, K
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 9 ページ: 4548
  • DOI: doi:10.1038/s41598-019-39973-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Exosome-associated Shiga toxin 2 is released from cells and causes severe toxicity in mice (2018)
  • 著者名/発表者名: Watanabe-Takahashi, M., Yamasaki, S., Murata, M., Kano, F., Motoyama, J., Yamate, J., Omi, J., Sato, W., Ukai, H., Shimasaki, K., Ikegawa, M., Tamura-Nakano, M., Yanoshita, R., Nishino, Y., Miyazawa, A., Natori, Y., Toyama-Sorimachi, N., Nishikawa, N.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 8 ページ: 10776
  • DOI: doi:10.1038/s41598-018-29128-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 「セミインタクト細胞リシール技術の新展開：「再構成」から「細胞編集」まで」 (2018)
  • 著者名/発表者名: 村田昌之、加納ふみ
  • 雑誌名: 生化学 巻: 90 ページ: 433-443
  • DOI: doi:10.14952/SEIKAGAKU.2018.900433
• [雑誌論文] 「セミインタクト細胞リシール技術を用いた細胞機能解析 」 (2018)
  • 著者名/発表者名: 國重 莉奈、加納 ふみ、村田 昌之
  • 雑誌名: 生体の科学 巻: 69 ページ: 247-251
  • DOI: doi:10.11477/mf.2425200804