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2019 年度 実施状況報告書

Rab2の細胞内ターゲティング過程の再構成と分子機構解明

研究課題

研究課題/領域番号 17K07379
研究機関東京工業大学

研究代表者

加納 ふみ  東京工業大学, 科学技術創成研究院, 准教授 (10361594)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2021-03-31
キーワード再構成 / Rabタンパク質 / セミインタクト細胞
研究実績の概要

低分子量Gタンパク質Rabファミリーは約60種類のタンパク質から形成され、各タンパク質が特定オルガネラに局在化し小胞輸送における様々な素過程に関与することが知られている。それぞれのRabタンパク質の特定オルガネラへの局在化メカニズムは一次配列によるものではなく、他のタンパク質との相互作用をもとに決定されると考えられる。本研究では、連鎖球菌毒素ストレプトリシンOを用いて細胞膜を透過性にした細胞型試験管セミインタクト細胞を用いて、リコンビナントタンパク質として精製したRab2タンパク質のER-Golg intermediate compartment (ERGIC, 小胞体-ゴルジ体中間区画)ターゲティング過程の再構成系を構築し、Rab2のERGIC局在化制御因子の探索を進めた。Rab2ターゲティングに必要な因子候補として、既存のRab2結合タンパク質に注目した。当該タンパク質に対する抗体を添加しRab2ターゲティングアッセイを行ったところ、抗体濃度依存的なRab2タンパク質のERGICターゲティングの減少が見られた。また、当該タンパク質のRNAiを行ったところ、ゴルジ体の若干の断片化とともにERGICに局在化するRab2量が減少していた。以上の結果から、当該Rab2結合タンパク質がRab2のERGICターゲティングに関与することが示唆された。また、Rab2リコンビナントタンパク質に結合し質量分析によって同定された新規Rab2結合タンパク質に対して弱いRab2への結合が確認されたため、引き続きRab2のERGIC局在への関与を検証することとした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

構築したRab2タンパク質のERGICターゲティングアッセイを用いて、既存のRab2結合タンパク質の関与を明らかにし、また生細胞でのRNAiの結果からも同様のことが示唆された。さらに質量分析の結果同定した新規Rab2結合タンパク質についてはRab2タンパク質との結合が見られなかったが、条件検討の結果弱いながらも結合が確認できた。

今後の研究の推進方策

既存のRab2結合タンパク質についてはERGICターゲティングへの関与を示せたため、今後はRab2の細胞内での機能への関与について検証を進める。また、新規Rab2結合タンパク質についてもRab2のERGIC局在化制御因子である可能性がまだ残っているため、ERGICターゲティングアッセイ、RNAiなどによるRab2局在化への関与を検証する。

次年度使用額が生じた理由

研究計画では、Rab2結合タンパク質を質量分析により同定し、Rab2のERGICターゲティング過程再構成系を用いて機能検証を行う予定であった。しかし、質量分析で同定されたタンパク質とRab2との結合確認が思うように進まず、遅れが生じた。次年度はこれまでに同定されたRab2のERGICターゲティング制御候補因子についてその機能を検証するため、当該因子のノックダウンなどの細胞生物学的・生化学的実験を行うための試薬などを購入する。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2020 2019

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] The cell resealing technique for manipulating, visualizing, and elucidating molecular functions in living cells2020

    • 著者名/発表者名
      Kunishige Rina、Kano Fumi、Murata Masayuki
    • 雑誌名

      Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects

      巻: 1864 ページ: 129329

    • DOI

      doi: 10.1016/j.bbagen.2019.03.015

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Pyk2-dependent phosphorylation of LSR enhances localization of LSR and tricellulin at tricellular tight junctions2019

    • 著者名/発表者名
      Nakatsu, D., Kano, F., Shinozaki-Narikawa, N., Murata, M.
    • 雑誌名

      PLOS ONE

      巻: 14 ページ: e0223300

    • DOI

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223300

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Semi-intact cell system for reconstituting and analyzing cellular Golgi dynamics.2019

    • 著者名/発表者名
      Kano, F., Murata, M.
    • 雑誌名

      The Golgi Apparatus and Centriole

      巻: 67 ページ: 233-250

    • DOI

      https://doi.org/10.1007/978-3-030-23173-6_10

    • 査読あり
  • [学会発表] セミインタクト細胞リシール技術を用いた細胞機能解析・評価系の開発2019

    • 著者名/発表者名
      國重莉奈、園田雄輝、村上真隆、加納ふみ、村田昌之
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会第14回年会
  • [学会発表] M型ピルビン酸産生酵素PKM1の減少は小胞体ストレス依存的な膵臓β細胞死を促進する2019

    • 著者名/発表者名
      中津 大貴, 村田 昌之, 加納 ふみ
    • 学会等名
      第19回日本蛋白質科学会年会 第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会
  • [学会発表] 細胞内温度変動に関与する分子のスクリーニング法の開発2019

    • 著者名/発表者名
      Takashi Mitsubori, Kohki Okabe, Fumi Kano, Takashi Funatsu
    • 学会等名
      第57回日本生物物理学会年会

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公開日: 2021-01-27  

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