一次繊毛由来細胞外小胞（pc-ECV）の生理機能解析

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K07381
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 池上 浩司 広島大学, 医歯薬保健学研究科(医), 教授 (20399687)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 細胞外小胞 / エクソソーム / 線毛

研究実績の概要

前年度に作成したマウス腎臓髄質内集合管上皮由来細胞の遺伝子破壊株に加えて，マウス線維芽細胞由来の細胞を用いて，CRISPR/Cas9によるゲノム編集を介して一次線毛形成に必須なタンパク質群をコードする遺伝子破壊株を作成した。作成した遺伝子破壊株および正常（野生型）細胞株の培養上清から超遠心法により細胞外小胞を沈殿し，培地に再懸濁した細胞外小胞濃縮液を作成した。一次線毛の生えていない遺伝子破壊株，すなわち一次線毛由来細胞外小胞を放出できない細胞株を細胞外小胞濃縮液（一次線毛由来細胞外小胞；含・不含）各々で処理し，細胞の応答を解析した。解析の結果，非常に微弱ながらも正常野生型細胞由来の細胞外小胞濃縮液で処理した細胞において，一次線毛由来細胞外小胞に含まれる生理活性タンパク質の発現増加が検出された。この発見は，新しい細胞間コミュニケーションツールとしての一次線毛由来細胞外小胞の生理学的機能を解明することを目的とする本研究にとって，その生理機能の一端に切り込んだ点で重要な成果となる。
上記の研究にくわえて，一次線毛由来細胞外小胞とエクソソームの放出に寄与する遺伝子の破壊株について細胞外小胞の細胞内局在を解析した。解析の結果，一次線毛は形成されるものの一次線毛由来細胞外小胞とエクソソームの放出が阻害される遺伝子破壊株では，エクソソームの細胞内貯留が検出された。これは一次線毛機能，一次線毛由来細胞外小胞放出，エクソソーム放出におけるそれら3者の相互作用の一端に切り込んだ点で重要な成果となる。
以上の2つの成果は，本研究に限らず線毛研究，細胞外小胞研究，これら二つの研究領域，さらには細胞生物学の研究界に大きな基礎的知見を与える点で大きな意義を持つ。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初計画どおり，一次線毛由来細胞外小胞の生理機能の一端に踏み込むことができた。くわえて，一次線毛由来細胞外小胞とエクソソームの放出に関して新しい知見を得ることができた。研究代表者の独立，異動，研究室の立ち上げなど，研究が一時的にストップした点を考慮すれば，おおむね順調に進展しているものと考えられる。

今後の研究の推進方策

平成30年度に発見した一次線毛由来細胞外小胞を含む細胞外小胞濃縮液の生理作用について更に解析を進める。とりわけ，一次線毛由来細胞外小胞を含む細胞外小胞濃縮液に暴露された一次線毛欠損あるいは一次線毛由来細胞外小胞放出能欠損細胞株について，細胞の形態，分裂速度，接触阻害効果，移動能など，各種細胞挙動を解析する。くわえて，平成30年度に発見した一次線毛，一次線毛由来細胞外小胞，エクソソーム，これら3者の相互連関について更に解析を進め，本研究課題終了後の研究展開および発展につながる異なる細胞外小胞放出系のクロストーク，その生理学的意義について新たな知見を得る。

次年度使用額が生じた理由

所属機関変更に伴う移動により年度前半の研究活動がやや停滞したことにより若干の次年度使用額が生じた。翌年度分（令和元年度分）の配分額と合わせた直接経費1,357,788円の使用計画はおおよそ下記のとおりである。
物品費：657,788円，旅費：100,000円，人件費・謝金：500,000円，その他：100,000円。研究実施の効率化のために人件費を多めに計上している。

研究成果

• [雑誌論文] Live cell imaging of dynamic behaviors of motile cilia and primary cilium (2019)
  • 著者名/発表者名: Ijaz F, Ikegami K
  • 雑誌名: Microscopy 巻: 68 ページ: 99-110
  • DOI: 10.1093/jmicro/dfy147
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] UBL3 modification influences protein sorting to small extracellular vesicles (2018)
  • 著者名/発表者名: Ageta H, Ageta-Ishihara N, Hitachi K, Karayel O, Onouchi T, Yamaguchi H, Kahyo T, Hatanaka K, Ikegami K, Yoshioka Y, Nakamura K, Kosaka N, Nakatani M, Uezumi A, Ide T, Tsutsumi Y, Sugimura H, Kinoshita M, Ochiya T, Mann M, Setou M, Tsuchida K
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 9 ページ: 3936
  • DOI: 10.1038/s41467-018-06197-y
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Environmental responsiveness of tubulin glutamylation in sensory cilia is regulated by the p38 MAPK pathway (2018)
  • 著者名/発表者名: Kimura Y, Tsutsumi K, Konno A, Ikegami K, Hameed S, Kaneko T, Kaplan OI, Teramoto T, Fujiwara M, Ishihara T, Blacque OE, Setou M
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 8 ページ: 8392
  • DOI: 10.1038/s41598-018-26694-w
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 培養腎臓髄質集合管上皮細胞におけるInpp5e依存的なエクソソームの放出 (2019)
  • 著者名/発表者名: 二宮昌彦、瀬藤光利、池上浩司
  • 学会等名: 第124回日本解剖学会総会全国学術集会
• [学会発表] 管腔面に生える『毛』の機能と新動態 (2018)
  • 著者名/発表者名: 池上浩司
  • 学会等名: 第59回日本脈管学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 細胞骨格微小管の翻訳後修飾と線毛に関するイメージング研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 池上浩司
  • 学会等名: 第73回日本解剖学会中国四国支部学術集会
• [備考] 広島大学大学院医系科学研究科解剖学及び発生生物学研究室
  • URL: http://anatomy.hiroshima-u.ac.jp/index.html
• [備考] 広島大学大学院医系科学研究科解剖学及び発生生物学研究室
  • URL: https://www.hiroshima-u.ac.jp/med/research/lab/basis/Anatomy_and_Developmental_Biology