| 研究課題/領域番号 |
17K07383
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
天野 睦紀 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (90304170)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 細胞内情報伝達 / リン酸化 / プロテインキナーゼ / 基質 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、プロテインキナーゼの基質認識機構の解析およびキナーゼの活性調節・モニタリングツールの開発を行う。昨年度は、Rho-kinaseとその基質であるMYPT1のキナーゼ・基質間相互作用の解析を行い、MYPT1の２箇所のリン酸化部位それぞれの近傍の十数アミノ酸程の領域がRho-kinaseとの相互作用に重要であることを見出し、ドッキングモチーフ１、２ (DM1, DM2) と名付けた。本年度はこれらドッキングモチーフについてさらに詳細な検討を行った。DM2を欠くとその近傍のリン酸化は大きく低下したが、DM1を欠いても近傍のリン酸化に対する影響は限定的であった。また、ドッキングモチーフや偽基質 (リン酸化部位を含む周囲の配列でリン酸化部位はAlaに置換、PS1, PS2と名付ける) ペプチドを作製し、in vitroでRho-kinaseに対して阻害効果があるかを検討したところ、PS2-DM2ペプチドはキナーゼ活性を阻害したが、それ以外のPSのみ、DMのみ、およびPS1-DM1ペプチドには阻害効果はほとんど無かった。このことより、DM2は近傍のリン酸化部位のリン酸化に必要十分であるが、DM1については必要であるが十分ではないと思われた。そこでDM1以外の領域を探索したところ、リン酸化部位を挟んでDM1と逆側の９アミノ酸の領域もRho-kinaseとの相互作用に重要であることが分かり、DM3と名付けた。DM1とDM3の両方を欠くと中央のリン酸化部位のリン酸化が大きく低下し、またPS1-DM3ペプチドがRho-kinase活性を抑制することを見出した（いずれもDM3のみでは効果が無かった）。以上のことより、Rho-kinaseがMYPT1を認識しリン酸化するためには、リン酸化部位に加えてドッキングモチーフ (DM1/DM3, DM2) が必要であることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、Rho-kinaseがその基質であるMYPT1をどのようにして認識しているか、基質認識機構の解析を行った。その結果、１箇所のリン酸化部位についてはN末側、C末側の両方に、もう一方のリン酸化部位はN末側にドッキングモチーフを持ち、ドッキングモチーフはそれぞれの近傍のリン酸化部位に対してRho-kinaseとの相互作用およびリン酸化部位のリン酸化に寄与していることを見出した。DM2とDM3は塩基性アミノ酸を多く含んでいたが、DM1とは配列類似性が無く、Rho-kinaseは少なくとも２種類の基質認識インターフェイスを持つことが示唆された。また、PS1-DM3ペプチド、PS2-DM2ペプチドがin vitroでRho-kinaseの活性を抑制したことから、新規のRho-kinase阻害薬として利用出来る可能性が示された。上述のように、Rho-kinaseとMYPT1のキナーゼ・基質相互作用機構の理解が大きく進み、また新規の活性調節ツールの候補も得られたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、キナーゼの基質認識機構の解析、キナーゼの活性調節・モニターツールの開発、およびシグナルネットワークの解析を行う。MYPT1については、Rho-kinaseとの相互作用インターフェースである３個のドッキングモチーフを同定・評価出来たため、KISS法で同定した他の基質について類似のドッキングモチーフが存在するか、検討する。また、Rho-kinase以外のキナーゼについても比較検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
MYPT1において同定した３個のドッキングモチーフの配列類似性が低かったことから、複数のインターフェイスが存在する可能性が高いと考えられ、また可変性が高くはっきりとしたコンセンサス配列が得られなかった。明確なコンセンサス配列が得られていれば、in silico解析で新規基質の推定や他のキナーゼ基質群との比較が可能であろうが、現状では次のフェイズに進むために、さらに多数のドッキングモチーフ例が必要と考えられた。そのため、既知のRho-kinase基質について結合実験やリン酸化実験を行ってドッキングモチーフの探索を続けており、想定以上の時間がかかったことで、研究費の一部を次年度に使用することとなった。
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