| 研究実績の概要 |
研究代表者は、ヒトES細胞のトランスクリプトーム解析を進める中で、神経ガイダンス因子SEMA6AがヒトES細胞で高発現していること、また多能性の喪失に伴い発現がドラスティックに低下することを見いだした。前年度に引き続き、ヒトES細胞におけるSEMA6Aの機能を明らかとするために、先行研究（Chen Y et al, Cell Stem Cell, 2015）のストラテジーに微調整を加えながら、SEMA6Aコンディショナルノックアウト(SEMA6A cKO)ヒトES細胞の樹立を試みた。本年度は、新たに調整し直したターゲッティングベクターを用いて、SEMA6A遺伝子のエクソン2をFlipase標的配列で挟んだゲノム編集細胞株を5クローン樹立、それぞれのゲノム改変はPCR及びシークエンスにて確認した。これらにタモキシフェン誘導型Flipaseの発現カセットをトランスポゾンシステムを用いて導入、タモキシフェン誘導体ドキシサイクリン添加によりFlipaseが発現誘導できること、数日間の培養でエクソン２欠損が生じることを確認した。ドキシサイクリン処理群におけるSEMA6Aタンパク質をウエスタンブロット、免疫染色により確認したところ、90%の細胞でSEMA6Aタンパク質が検出できなかった。興味深いことに、ドキシサイクリン処理群は２週間培養後のコロニー数が大きく減少していた。すなわち、エクソン2欠損によりSEMA6A遺伝子の誘導型ノックアウトが達成できたこと、SEMA6A欠損によりES細胞の自己複製に異常が生じることがわかった。この結果からES細胞におけるSemaphorinシグナルの必要性が示唆された。
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