| 研究課題/領域番号 |
17K07396
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
上村 陽一郎 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 上級研究員 (20321599)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 走化性 / 三量体Ｇタンパク質シャトリング / Gip1 / 細胞性粘菌 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、走化性のダイナミックレンジを広く維持する三量体Ｇタンパク質シャトリングに注目する。このような制御にはGip1とＧタンパク質の複合体形成が重要な役割を果たす。
そこで本年度は、「Gip1とＧタンパク質の結合様式」について解析を進めた。Gip1はそのC末端側でＧタンパク質と結合する。このドメインをバクテリアから精製し、濃縮後、動的光散乱法とネイティブPAGEにより結晶作製に適しているか確認をした。このサンプルを用いて蒸気拡散法による結晶化条件を検討した結果、PEG20,000、Bicine (pH8-9)存在下で結晶が生成した。この結晶にX線を照射し、回折像を得た。このデータから、Gip1ホモログであるTIPE2を用いた分子置換法により初期構造モデルを構築し、精密化を行った。その結果、Gip1は予想通り、疎水性の穴をもつことがわかった。また、その外側は荷電をもつアミノ酸が比較的多く存在し、細胞質での局在と矛盾しないものであった。
次に、Gip1との複合体形成においてＧタンパク質の脂質修飾部位の関与を調べた。まず、γサブユニットにゲラニルゲラニル修飾が入っていることを質量分析法により確認した。次に、脂質修飾を持たない変異γサブユニットの発現株を作製し、GIp1との結合を調べたところ、全く結合がみられなくなった。このことから、この両者の複合体形成にはＧタンパク質の脂質修飾が必須であることがわかった。
さらに、得られたGip1の構造から、その疎水性の穴を塞ぐ変異を導入した。この変異GIp1はＧタンパク質との結合性がなくなり、その結果、細胞内のGタンパク質は細胞質に局在できなくなった。
これらの結果から、Gip1はその疎水性の穴にＧタンパク質がもつ脂質修飾を収納することで複合体を形成することがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究計画では「Gip1と三量体Ｇタンパク質の結合様式の解析」を目標とした。そのために、Gip1のX線構造を決定した。また、Gip1との複合体形成において三量体Ｇタンパク質の脂質修飾が必須であることを確認した。さらに、Gip1のX線構造から疎水性の穴に変異を同定し、この構造がその機能に必須であることを示した。これらの結果から、目標とした「Gip1とＧタンパク質の結合様式」をほぼ理解できたと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度はGip1と三量体Gタンパク質との複合体形成に関して構造的な理解が得られた。今後は、三量体Gタンパク質と結合できない疎水性の穴に変異をもつGip1が走化性ダイナミックレンジ制御に関与するかについて検証する必要がある。また、Gip1の構造から得られた知見を確認するため、網羅的なアラニンスキャン変異法により、Gip1のGタンパク質シャトリングへの構造機能解析を進める予定である。これらの結果が得られた段階で、論文として発表する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度に計画していたGip1タンパク質の結晶化に関して、当初予定よりも少ない検討で成功した。繰越し金については、次年度に行う細胞の表現型解析に必要な消耗品等に使用する予定である。
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